摘要：旨在建立一种新型冠状病毒实时荧光逆转录重组酶聚合酶恒温快速的检测技术(RT-RPA)用于新型冠状病毒的检测与监测。根据新型冠状病毒保守的特异性S基因以及N基因序列,设计了两套RPA引物、探针;同时基于N基因等靶标序列构建重组载体,构建新型冠状病毒假病毒颗粒(VLPs)作为阳性质控品。经验证,筛选出一套基于S基因以及N基因的双重RPA引物、探针组合,其分析敏感度S基因引物探针可达10 copies/reaction,N基因引物探针分析敏感度可达102 copies/reaction;分析特异性良好,与H1N1流感病毒、PEDV、TGEV、FMDV、PPRV以及RV病毒无交叉反应。该方法建立后,应用于食品、动物组织器官及临床样本的检测。该方法可特异性从上述样本中检测到新型冠状病毒,表明其具有速度快(20 min)、双靶标、灵敏度高、操作简便,对仪器设备要求低等优点,可用于新型冠状病毒在食品、动物产品以及临床样本中的快速筛查。

摘要：建立基于重组酶介导的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）核酸检测方法。本研究设计、合成特异性中东呼吸综合征冠状病毒基因的重组酶介导检测（RAA）引物及探针,制备MERS-CoV假病毒颗粒阳性对照品,通过一系列条件优化建立了MERS-CoV的快速、灵敏、特异的RT-RAA检测方法,分别与荧光定量RT-PCR检测方法做比较,并且采用首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品、其它类似呼吸道病毒样本以及英国QCMD的MERS-CoV室间质评灭活样本做临床验证。结果显示：建立的RT-RAA方法检测中东呼吸综合征冠状病毒灵敏度为10拷贝,高于本实验室建立的荧光RT-PCR方法灵敏度（100拷贝）,且检测时间（4.8~13.6min）大大低于荧光RT-PCR检测时间（90min）;用该方法检测中东呼吸综合征冠状假病毒颗粒为阳性,而检测其他8种对照呼吸道病毒均呈阴性;检测临床阳性样本也与实际结果相符。本研究建立的中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA检测方法灵敏、特异、快速,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的现场快速诊断和流行病学调查。

摘要：目的建立狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法，制备狂犬病病毒（rabies virus，RV）的假病毒颗粒阳性对照。方法在RV的N基因保守区设计引物和探针，建立反转录实时荧光定量PCR检测方法，克隆得到噬菌体MS2的装配蛋白和壳蛋白基因（MS2），将其重组到质粒pET-28b（＋）中，再将RV的N基因片段重组到MS2下游，经原核表达得到RV假病毒颗粒。结果实时荧光定量PCR检测RV重组质粒最低检测限为15拷贝／μl，重组表达质粒经原核表达可形成耐RNase的RV病毒样颗粒。结论建立了反转录实时荧光定量PCR检测RV核酸的方法，成功构建了可耐受RNase且无传染性的RV阳性对照。

摘要：目的建立一种快速、准确定量HCV-RNA的实时荧光定量PCR检测方法。方法 Clustal X软件对HCV核酸序列进行比对分析,在HCV-RNA的保守区域5'UTR设计引物和探针,棋盘滴定法对实时荧光定量PCR体系进行性能优化,制作假病毒颗粒作为定量标准品对新建方法进行性能评价,并与临床常用HCV-RNA定量检测试剂盒进行比对分析,探讨其应用价值。结果建立HCV核酸定量高灵敏度方法,该方法可以检测1a,1b,2a,3a,3b,6a,6b等多个HCV基因型,检测HCV-RNA的灵敏度为50 IU/ml,精密度CV<5%,检测结果可溯源至卫生部临床检验中心丙型肝炎病毒核酸(HCV-RNA)血清标准物质GBW09151a。新建方法与凯杰HCV-RNA荧光定量检测试剂盒同时检测40例临床样本,阳性一致率为100%,阴性一致率为56%;自建方法检测阳性的14个样本中,凯杰试剂0个阳性,表明自建方法的检测灵敏度要高于凯杰试剂。结论建立的HCV核酸定量新方法灵敏度高、特异性好、精密度高,可应用于临床。

摘要：目的建立快速、敏感、特异的逆转录重组酶介导(Reverse-transcription recombinase-aid assay,RT-RAA)核酸检测方法,用于中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)的检测。方法根据MERS-Co V基因的保守序列设计并合成特异性RAA引物及探针。通过条件优化,以10倍系列稀释经第3代慢病毒载体构建的假病毒颗粒阳性标准品为模板,进行RT-RAA扩增,并进行特异性、敏感性以及临床样本检测。结果建立的RT-RAA方法检测MERS-Co V假病毒颗粒阳性标准品的灵敏度为10拷贝/ml,高于实时荧光RT-PCR方法(10~2拷贝/ml);用该方法检测MERS-Co V假病毒颗粒有明显扩增,而甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒等4种呼吸道病毒的检测均为阴性;检测我国首例输入性MERS病例的临床样本及1例英国QCMD协会的室间质评阳性灭活样本均能检出,与实际结果相符。检测时间(20 min)大大低于实时荧光RT-PCR(90 min)。结论建立的MERS-Co V RT-RAA检测方法灵敏、特异、快速,可用于MERS-Co V感染的现场快速检测和流行病学调查。