摘要：建立并优化犬特异性寡脱氧核苷酸(CpGODN)的体外筛选条件,筛选自行设计的对犬具有免疫刺激活性的CpGODN。用CpGODN2006对犬的免疫细胞进行刺激,测定细胞增殖能力。对免疫细胞的来源、细胞铺板浓度、CpGODN的刺激时间和浓度及增值能力的测定方法等条件进行优化。并对自行设计的CpGODN进行了初步筛选。结果显示,犬脾细胞对CpGODN的反应性比外周血单个核细胞好。在犬脾细胞为6×105个/孔,37℃5%CO2条件下,经10mg/LCpGODN2006刺激48h,使脾细胞明显增生。3H-TdR掺入法测得的结果比MTT法更敏感。自行设计的CpGODNR008能显著地刺激犬脾细胞增生,且优于CpGODN2006(P<0.05)。结果表明,优化了犬特异性CpGODN的体外筛选条件,并筛选出了对犬具有免疫刺激活性的CpGODN。

摘要：分别用有丝分裂原和CpG寡脱氧核苷酸 (CpGODN)对SPF鸡全血 ,经低速离心分离的外周血单个核细胞(PBMC)和脾脏细胞 ,用淋巴细胞分离液分离的PBMC和脾脏细胞进行刺激 ,用3 H TdR掺入法测定并比较上述鸡免疫细胞在不同培养温度和细胞浓度下的转化效果 ,从而建立了适用于大批量筛选对鸡具有免疫刺激活性CpGODN的淋巴细胞转化方法。进一步用该方法筛选自行设计合成的 38条ODN。结果表明 ,用低速离心法分离的鸡PBMC ,在细胞含量为10 7mL-1、 37℃、 5 %CO2 条件下 ,经CpGODN刺激 6 4～ 6 6h后 ,可以得到稳定的高效转化 ;不含CpG模体的ODN不具有免疫刺激活性 ;CpGODN 10、 11和 14具有最佳的免疫刺激活性 ,刺激指数大于 10。

摘要：目的设计和筛选对人PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpGODN序列，研发能用于人用疫苗的有效核酸佐剂。方法根据具有免疫刺激活性的CpGODN序列结构特点，设计并合成出15条候选序列，分别合成并进行非硫代和硫代修饰。分选健康人PBMC细胞及Balb／c小鼠脾细胞，以不同CpGODN进行体外刺激，MTT法检测CpGODN诱导细胞增殖水平。随后将筛选出的有效CpGODN序列与人类基因组序列进行同源性比较，以评估其安全性。结果在刺激人PBMC和小鼠脾细胞72h后，硫代和非硫代修饰的15条序列A值均高于阴性对照组，其中IMB—AC5序列刺激人PBMC后A值分别达到0．377和0．334，与阳性对照ISS1018序列A值（0．387和0．338）接近；刺激小鼠脾细胞72h后，A值同样高于其他序列，达到0．571和0．486，与阳性对照ISS1018序列A值（0．588和0．464）接近。综合上述结果，选择5号非硫代序列作为候选佐剂。同源性比较结果显示，该序列与人类基因组序列没有同源性，与部分蛋白编码基因的同源性只有50％～65％，此外其部分序列与人18号染色体上的一些重复序列有同源性，最高同源性达62％。证明筛选出的新型CpGODN佐剂IMB—AC5安全性较高。结论设计筛选出对人PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpGODN序列IMB—AC5，与人类基因组序列具有较低同源性，为进一步研发人用疫苗佐剂奠定基础。