摘要：目的筛选和鉴定日本血吸虫磷酸丙糖异构酶(SjTPI)的Th1型细胞表位,为构建短肽疫苗奠定基础。方法用BLAST比对并预测SjTPI的T细胞表位SjTPI-P18及其对照表位SjTPI-P9。设计并合成其编码DNA,重组入原核表达载体pET-32c(+)后进行表达,获得纯化的重组融合蛋白rSjTPI-P18和rSjTPI-P9。用rSjTPI、rSjTPI-P18及rSjT-PI-P9刺激经照射致弱尾蚴免疫、rSjTPI加强免疫的C57BL/6和C3H/HeJ小鼠淋巴细胞,3H-TdR掺入法检测淋巴细胞的增殖效果及细胞培养上清中IL-2水平;分别用重组rSjTPI-P18和合成SjTPI-P18刺激rSjTPI-P18、SjTPI-P18或PBS加弗氏佐剂两次免疫的C57BL/6小鼠淋巴细胞,并检测其细胞培养上清中IFN-γ及IL-4水平。结果参照曼氏血吸虫TPI T细胞表位预测的SjTPI-P18及SjTPI-P9,获得了与Trx融合表达的重组肽rSjTPI-P18及rSjTPI-P9。与rSjTPI-P9相比,rSjTPI及rSjTPI-P18均可刺激辐照致弱尾蚴免疫、rSjTPI加强免疫的C57BL/6或C3H/HeJ小鼠的淋巴细胞增殖且IL-2分泌量增加(P均<0.05);SjTPI-P18及rSjTPI-P18刺激经rSjTPI-P18或SjTPI-P18免疫两次的C57BL/6小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ水平升高(P均<0.05),而IL-4水平较低。结论筛选和鉴定出的SjTPI-P18是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位。

摘要：目的克隆表达屋尘螨过敏原Derp 4重组蛋白,鉴定其免疫原性并对其生物信息学进行分析。方法根据已知Derp4基因序列,设计PCR引物,提取屋尘螨总RNA,逆转录PCR(RT-PCR)扩增Derp4基因。将测序正确的基因片段克隆至pET-28a(+)载体,提取质粒测序鉴定,将重组质粒转入Rosetta2(DE3)pLysS感受态细胞,1 mmol/LIPTG诱导表达后,采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况。亲和层析法纯化重组蛋白后,以屋尘螨过敏患者血清为一抗,蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫原性。以纯化后的重组蛋白为包被抗原,间接ELISA法检测30份尘螨过敏患者血清IgE,鉴定其特异性。利用ProtParam tools、SignalP5.0、NetPhos3.1、CD-search、Alphafold、Immune Epitope Database and Analysis Resource(IEDB)等软件和生物信息学预测抗原肽(BPAP)系统等对Derp 4的理化性质、信号肽序列、磷酸化位点、二级和三级结构及B细胞抗原表位进行生物信息学分析。结果RT-PCR扩增出长度为1090 bp的条带。重组质粒测序结果显示,插入的片段为全长1090 bp的Derp 4基因序列。SDS-PAGE分析结果显示,Derp 4重组蛋白为包涵体蛋白,相对分子质量(Mr)约60000,经纯化后的重组蛋白纯度>90%。Western blotting分析结果显示,Derp 4重组蛋白可与尘螨过敏患者血清中的IgE特异性结合,在Mr60000处有明显条带。间接ELISA检测结果显示,Der p 4重组蛋白与14份(46.67%)尘螨过敏患者血清呈特异性IgE结合。生物信息学分析显示,Der p 4蛋白稳定性较高,无信号肽结构,二级结构和三级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主;IEDB和BPAP系统预测到Derp4蛋白存在15个B细胞抗原表位肽序列。结论纯化的Der p 4重组蛋白具有免疫原性,与屋尘螨过敏患者血清中的IgE抗体结合较好。

摘要：目的　采用表位重建技术 ,对预测MAGE n抗原HLA A2限制性CTL表位结合活性进行研究。方法　用SYFPEITHI超基序法远程预测系统和量化基序多项式法结合的预测方法 ,筛选新的MAGE n抗原HLA A2限制性CTL表位作为候选表位。对预测的抗原表位进行多肽合成 ,并用HPLC进行纯化 ,质谱法 (MS)鉴定。候选表位与HLA A2位点的亲和力及结合稳定性用竞争结合抑制实验、T2结合稳定性实验及MHC 肽复合体稳定性实验测定。结果　用表位预测法筛选MAGE n抗原 5个HLA A2限制性CTL表位为候选表位。QLVFGIEVV(15 9 16 7)、IMPKTGFLI(195 2 0 3)和FLIIVLVMI(2 0 1 2 0 9) 3个表位具有较高的HLA A2结合力 (IC50 6h) ,可作为MAGE n抗原HLA A2限制性CTL候选表位进行进一步研究。结论　表位预测结合表位重建方法可提高肿瘤抗原CTL表位研究的效率。MAGE n抗原HLA A2限制性CTL表位经免疫学鉴定后 ,可望用于新型肝癌治疗性多肽疫苗的设计研究 ,为临床肝癌特异性治疗奠定基础。

摘要：目的对屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)8类变应原Der p 8进行克隆表达、纯化及免疫原性分析,并用生物信息学方法分析其同源性。方法根据已知Der p 8基因序列,设计PCR引物;提取屋尘螨总RNA,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到Der p 8的cDNA片段,以cDNA和设计的引物进行PCR扩增;扩增产物连接至T载体并转化入大肠埃希菌(*** Top10)中,培养后挑选阳性单克隆菌落测序。测序正确后,转入表达载体pET-32a,经酶切鉴定、测序后转入表达菌BL21,大量表达重组蛋白Der p 8。用亲和层析法纯化后进行免疫印迹分析(Western blotting)。利用生物信息学方法分析Der p 8基因的同源性。结果酶切鉴定显示Der p 8表达载体构建成功,目的基因分子量约为700 bp;SDS-PAGE电泳显示Der p8重组蛋白成功表达,分子量约为38 kD,且主要以包涵体形式存在。Western blotting结果显示Der p 8重组蛋白具有免疫原性。同源性分析结果显示本实验克隆Der p 8基因与NCBI基因库的Der p 8基因同源性为76.97%。结论本实验成功克隆表达并纯化出具有免疫原性的Der p 8重组蛋白,为临床上应用重组蛋白于诊断和治疗提供理论基础。

摘要：目的屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)是引起过敏性疾病的主要过敏原,鉴定其免疫原性是研究哮喘和其他过敏性疾病的基础。由于不同地区生物的多样性,本实验在国内首次对屋尘螨Der p 21进行克隆、表达和免疫原性鉴定。方法提取屋尘螨总RNA,RT-PCR扩增Der p 21的cDNA片段,根据已知Der p 21序列设计出表达引物,再通过已获得的cDNA和引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到克隆载体上并转入克隆菌*** Top10中,涂板过夜培养,挑选菌落,保菌,取样送至公司测序。将测序正确的基因转入表达载体PET32中,经酶切鉴定测序再转入表达菌BL21中,大量表达重组蛋白Der p 21经过纯化后,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白表达并进行免疫印迹分析(Western blotting)。结果双酶切显示Der p 21已成功连接在载体上,SDS-PAGE显示目标基因在大肠埃希菌BL21成功表达,纯化后的重组Der p 21蛋白分子量约为50 kD,Western blotting结果显示有明显条带。结论成功克隆表达Der p 21 cDNA,表达和纯化出重组蛋白,并具有免疫原性。

摘要：目的在毕赤酵母菌(Pichia pastoris)中表达德国小蠊主要变应原Blag2,以获得其可溶性蛋白。方法根据已知的Bla g 2基因序列设计带有酶切位点的引物。PCR扩增德国小蠊变应原Blag2基因,经酶切后将该基因连接到毕赤酵母真核表达载体pGAPZaA,获重组质粒pGAPZaA-Blag2,该重组质粒线性化后,经电转化法转化毕赤酵母GS115,用PCR筛选出重组子并在YPD培养基中表达。用Ni2+亲和层析法纯化重组蛋白Bla g2,用蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫学活性。结果重组质粒pGAPZaA-Blag2转化毕赤酵母GS115后进行表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)分析显示,重组蛋白Blag2表达产物以可溶性分子形式存在,相对分子质量(Mr)为45 000。培养3 d的表达量占上清总蛋白的50％。表达产物重组蛋白Blag2经Ni2+亲和层析纯化后,Western blotting分析,在约Mr 45 000处有1条明最的特异性条带,该蛋白具有免疫学活性。结论获得了真核表达的德国小蠊主要变应原重组蛋白Blag2,该蛋白以可溶性蛋白的形式分泌到培养液中,避免了原核表达的变复性过程。

摘要：目的德国小蠊(Blattella germanica)的分泌物、排泄物、蜕皮产物和尸体中携带含有大量过敏原,其中Bla g 5是引起过敏性疾病的一类重要过敏原。使用大肠杆菌克隆表达德国小蠊过敏原Bla g 5,然后使用过敏性疾病患者的血清IgE测试其变应原性。同时使用生物信息学预测Bla g 5基因的作用,了解到其分子特征。方法首先提取德国小蠊的总RNA,并根据已知的Bla g 5基因序列(GenBank:U92412)设计基因特异性引物。扩增其cDNA,并通过酶切连接构建表达载体pET-28a(+)-Bla g 5,然后转化入感受态细胞Rosetta(DE3)。选择单克隆阳性菌落进行扩增和培养。用0.1 mm/mol IPTG诱导目的蛋白的表达,然后通过金属螯合层析法纯化表达产物,并通过Western印迹法鉴定纯化产物的免疫学特性。结果对表达产物进行了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),发现可溶性表达的Bla g 5蛋白的分子量约为25 kDa,与理论结果相符。纯化的重组蛋白的免疫印迹结果表明,Bla g 5可以特异性结合过敏患者的血清IgE。基于基因序列,我们预测了Bla g 5二级和三维结构、亲水性、可塑性、抗原性、表面可及性、同源性。发现其具有典型的谷胱甘肽硫转移酶(GST)特征。结论本研究中异源表达的德国小蠊Bla g 5过敏原蛋白对过敏患者的血清具有更高的结合活性,为相应的变应性疾病的诊断试剂和疫苗的开发研究奠定了基础。