摘要：基于纳米抗体(nanobody,Nb)的免疫磁珠,因其独特的性能在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化等领域受到广泛关注。但目前国内外缺乏对基于Nb与生物源性磁颗粒(bacterial magnetic particles,BMPs)和化学合成的磁颗粒(magnetic particles,MPs)构建的免疫磁珠性能差异的研究。本研究以3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid,3-PBA)Nb作为研究对象,通过基因工程技术在其C-端引入半胱氨酸(cysteine,Cys),获得Nb-6His-Cys重组蛋白质。利用双功能交联试剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate,SPDP)将Nb-6His-Cys分别与BMPs和MPs进行偶联获得免疫磁珠,评价2种免疫磁珠的性能差异。结果表明,SPDP能够分别将Nb-6His-Cys定向固定在BMPs和MPs表面上;磁珠表征发现,BMP-Nb的水合粒径、电位和分散性均优于MP-Nb(BMP-Nb的水合粒径为68.43±24.54,电位-27.89 mV,分散性0.57;MP-Nb的水合粒径为27.31±5.28,电位-26.12 mV,分散性0.44);通过差值法计算发现,BMPs可展示更多的Nb-Cys(1 mg的BMPs上能够展示697±16μg 3-PBA Nb-Cys,1 mg的MPs上能够展示569±18μg 3-PBA Nb-Cys)。综上研究表明,Nb和BMPs构建的免疫磁珠性能优于Nb和MPs构建的免疫磁珠,本实验为合理选择免疫磁珠检测方法提供了理论依据,为实现3-PBA的环境快速检测提供物质支撑。

摘要：背景:免疫磁珠分选技术已成为分选CD34+细胞的主要方法之一,在长期实验中发现诸多因素影响其分离纯度,包括磁珠与细胞孵育时干冰与碎冰的使用、磁珠与细胞孵育及分离时摇床的摇摆方向、红细胞裂解液裂解单个核细胞的使用等。目的:在免疫磁珠分选CD34+细胞过程中分别对上述影响因素进行分析改进,以提高分选CD34+细胞的纯度。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-07/2009-03在太原市中心医院皮肤科实验室完成。材料:骨髓象筛选正常的人骨髓29份,由太原市中心医院血液科提供,取材均经患者同意。CD34+免疫磁珠为Dynal公司产品。方法:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离培养人骨髓单个核细胞,用免疫磁珠法分选骨髓CD34+细胞,对其分选过程中的主要环节如冰块与碎冰、摇床的种类以及红细胞裂解液的使用进行方法改进。方法1:按试剂盒提供方法进行磁珠常规分选CD34+细胞。方法2:在方法1基础上,用碎冰替代冰块进行磁珠与单个核细胞孵育。方法3:在方法2基础上,用万向摇床替代水平摇床。方法4:在方法3基础上,向单个核细胞中预先加入红细胞裂解液裂解残留红细胞。主要观察指标:通过流式细胞仪检测不同方法分选出的CD34+细胞纯度。结果:随着不同环节的逐渐改进,CD34+细胞纯度由(32.7±6.6)%升至(84.5±5.2)%,方法1,2,3,4所分选出的CD34+细胞纯度逐渐升高,组间方差分析差异显著(F=76.209,P<0.01),Bonferroni法两两比较差异亦有非常显著性意义(P<0.01)。结论:碎冰、万向摇床及红细胞裂解液的使用能有效提高免疫磁珠法分选人骨髓CD34+细胞的纯度。

摘要：目的建立一种免疫磁珠结合PCR-免疫金标试纸条快速检测金枪鱼成分的方法。方法使用免疫磁珠法提取金枪鱼样品的核酸,针对金枪鱼基因组特异性基因片段设计引物,优化反应体系和反应条件,建立金枪鱼成分PCR产物试纸条检测方法,验证方法的特异性、灵敏度和稳定性,并对市售金枪鱼产品进行检测。结果免疫磁珠法提取市售金枪鱼样品DNA的纯度高。所建立的PCR-试纸条方法特异性强,仅金枪鱼能扩增出229 bp特异性DNA片段,试纸条检测线变红,其他鱼类均无非特异性扩增条带,试纸条检测线未变红色;灵敏度高,达到0.01%;方法快速,PCR产物的试纸条判读时间5 min。结论该方法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、简便环保等优点,适用于金枪鱼成分的快速检测。

摘要：目的建立定量检测粪便中具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,***)的免疫磁珠捕获联合实时荧光定量PCR(IMBs-qPCR)技术方法。方法5×***(0.4%甲醛灭活)免疫新西兰兔制备多克隆抗体,饱和硫酸铵沉淀法和HiTrap Protein G HP亲和层析法纯化抗体;优化MS300免疫磁珠偶联多克隆抗体和捕获***的反应条件。根据***特异性基因NusG设计引物和构建含目的基因的载体质粒,建立qPCR反应体系并绘制qPCR标准曲线。最后,在不同浓度(50CFU/200mg^10^5CFU/200mg)***的人粪便标本中,评价该方法的检测效能。结果成功制备***多克隆抗体,抗体ELISA效价>320000,盐析和亲和层析纯化抗体纯度分别为60%和85%;多克隆抗体偶联免疫磁珠时偶联缓冲液最佳pH值为5.0,最佳温度为25℃,最佳偶联时间为2.5h,加入抗体最适量为10μg/mg,免疫磁珠最佳捕获温度为37℃,时间为40min;成功建立qPCR反应体系;IMBs-qPCR和粪便全基因组DNA提取法直接检测模拟粪便标本最低检测限分别为100CFU/200mg和400CFU/200mg,ROC曲线中AUC分别为0.948和0.878。结论成功建立了IMBs-qPCR检测粪便中***的方法,该方法具有简便快速、灵敏度高、特异性好等特点。

摘要：目的基于免疫磁珠分离及多重PCR技术建立出血性大肠埃希菌、福氏志贺菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌的快速检测体系。方法根据出血性大肠埃希菌uidA、福氏志贺菌ipaH、空肠弯曲菌hipo及副溶血弧菌tlh的基因序列设计特异性引物,优化免疫磁珠分离过程及多重PCR扩增中的各个环节,建立上述4种病原菌同步快速扩增体系,并鉴定该体系特异性、敏感性。结果发现Mg2+浓度对该体系影响最大,在Mg2+浓度为4 mmol/L时扩增效率最高;该体系对4种病原菌的敏感性分别为:出血性大肠埃希菌2.7×10 cfu/ml、福氏志贺菌6.4×10 cfu/ml、空肠弯曲菌7.6×10 cfu/ml、副溶血弧菌3.6×10 cfu/ml。结论建立了出血性大肠埃希菌、福氏志贺菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌的免疫磁珠-多重PCR快速检测体系,该体系特异性及敏感性高,检测过程简单,结果稳定,可应用于临床诊断及食品卫生监管中致病菌的快速检测。

摘要：目的基于可重复利用的免疫磁珠,建立一种简捷快速的特异性抗体检测方法。方法设计人类巨细胞病毒(humancytomegaloviruses,HCMV)PP150蛋白的抗原表位,并合成8分枝多聚抗原肽PP150-8MAPs。将PP150-8MAPs以共价结合形式包被于DynabeadsM-450Tosylactivated磁珠表面,制备特异性免疫磁珠。用PP150-8MAPs免疫Balb/c小鼠制备抗此抗原表位的标准抗血清。应用免疫磁珠检测标准抗血清中的抗体,优化检测条件。在抗体检测反应结束后,洗脱抗体-二抗复合物,再生后的免疫磁珠重复用于标准抗血清样品的检测分析,并分析免疫磁珠可重复利用的次数。结果制备免疫磁珠时,PP150-8MAPs的最佳包被量为100μg/mL,包被效率为79%。用PP150-8MAPs免疫小鼠后,得到的抗血清滴度可达到112800。用免疫磁珠法检测小鼠标准抗血清,免疫磁珠可重复进行20次以上的检测分析。结论基于酶联免疫检测方法,包被抗原的免疫磁珠可重复应用于血清样品中特异性抗体的检测分析。此实验为建立一种新的可重复检测的高效清样品中特异性抗体的检测分析。此实验为建立一种新的可重复检测的高效免疫磁珠抗体分析方法奠定了基础,在基础研究与临床检测中具有广泛的应用前景。

摘要：为建立高效、快速和准确检测布鲁氏菌病原的免疫磁珠qPCR方法,本研究根据GenBank已经发表的布鲁氏菌流产株BRS 19 ku外膜蛋白(Omp19)基因组序列来设计qPCR方法所需要的引物和探针,利用免疫磁珠富集浓缩样品中少量的布鲁氏菌病原,建立了布鲁氏菌免疫磁珠qPCR检测方法。采用qPCR方法对免疫磁珠分离的布鲁氏菌的敏感性、特异性、稳定性及临床应用进行了研究。结果显示,免疫磁珠qPCR方法检测布鲁氏菌的最低检测限为1×10^3CFU/mL。该方法可以扩增不同种型布鲁氏菌,对其他细菌没有发生交叉反应。该方法的批内和批间的变异系数均低于10%,具有较高稳定性。免疫磁珠qPCR方法与常规qPCR的符合率为94.74%,具有良好的吻合性。上述结果表明,本研究建立的免疫磁珠qPCR方法检测布鲁氏菌具有较高的敏感性、特异性和稳定性,为布鲁氏菌病的准确诊断检测和流行病学调查提供技术支撑。

摘要：构建重组基因克隆表达副溶血弧菌外膜蛋白ompK并制备多克隆抗体,建立副溶血弧菌的免疫磁珠富集,结合化学显色检测方法。利用生物软件Primer 5设计副溶血弧菌ompK基因的引物,通过PCR扩增出ompK基因,并将其克隆至pET28a(+)原核表达载体,转化至大肠杆菌BL21进行优化表达。镍柱纯化表达产物,免疫小鼠,制备其多克隆抗体。Western blot鉴定重组蛋白,ELISA分析其免疫原性。间接ELISA检测多抗效价及交叉性,并与protein G磁珠偶联结合显色平板检测副溶血弧菌。结果显示,成功表达ompK蛋白;免疫小鼠获得特异性抗血清,效价为1∶64 000;Western blotting证明抗血清能与副溶血弧菌28 kD处条带特异性结合。制备的免疫磁珠敏感度最高能达到104CFU/mL。成功克隆表达副溶血弧菌外膜蛋白ompK并制备副溶血弧菌特异性鼠多克隆抗体,建立的免疫磁珠检测方法与显色平板法结合较传统的二次增菌法能够节省72 h,整个过程只需要传统方法时间的1/3;相比于常用的免疫学检测方法检测灵敏度提高两个数量级。

摘要：利用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)多克隆抗体构建的免疫磁珠富集IBV,对Gen Bank中896株IBV S1基因序列及其多变区进行分析,根据IBV强毒株和弱毒疫苗株序列差异设计引物,建立了一种基于免疫磁珠富集IBV后检测S1基因多变区的多重RT-PCR方法。结果表明:该方法能扩增出强毒株约710 bp的通用片段和约350 bp的特异片段,弱毒疫苗株能扩增出约710 bp的通用片段和约210 bp的特异片段,能鉴别出强毒株和弱毒疫苗株。免疫磁珠富集IBV后比不富集病毒用RT-PCR方法检测敏感性提高100倍。该方法为IBV检测提供了新的技术支持。

摘要：本文设计了一款观测免疫磁珠在振动磁场作用下磁振特性的系统,解决了处于微米级别的磁珠运动在肉眼下不可见的问题。实验研究表明,系统设计满足观测要求,且磁珠振动的频率和振幅受振动磁场的频率和振幅的影响。