摘要：假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷,在生物和医药领域用途广泛。现有的假尿苷制备方法普遍存在步骤繁琐、生产效率低、生产成本高等缺点。本研究在大肠杆菌中设计了新颖的酶级联反应路线,并实现了全细胞催化尿苷制备假尿苷。首先,质粒过表达内源的假尿苷-5-磷酸糖苷酶、核糖激酶和核糖核苷水解酶,构建出尿苷到假尿苷的代谢途径,实现了假尿苷的积累;然后,筛选内源的高活性核糖核苷水解酶,促进了尿苷的水解,为假尿苷的合成提供了更多前体;接着,对底物与产物的转运途径进行改造,提升假尿苷产量的同时避免了副产物尿苷的积累。最终获得的重组菌株Ψ-7在24 h内可以全细胞催化30 g/L尿苷产生27.24 g/L假尿苷,转化率为90.8%,生产效率为1.135 g/(L·h),假尿苷产量和生产效率为现有酶催化法报道的最高值。

摘要：2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP)在食品香料与医药方面具有重要的经济价值,工业上普遍采用环境不友好且反应条件苛刻的化学合成法来生产。文中结合代谢工程和辅因子工程策略设计高效催化L-苏氨酸合成2,5-DMP的全细胞催化剂,实现微生物转化法合成2,5-DMP。本研究首先分析了不同微生物来源的苏氨酸脱氢酶(Threonine dehydrogenase,TDH)对2,5-DMP合成的影响,发现来源于大肠杆菌Escherichia coli中EcTDH具有最佳的催化能力,2,5-DMP产量达到(438.3±23.7)mg/L。随后结合辅因子工程,通过引入乳脂链球菌Lactococcus cremoris中NADH氧化酶(NADH oxidase,LcNox E)并优化其表达方式发现通过融合表达EcTDH和Lc Nox E可平衡胞内NADH/NAD+水平,维持较高细胞存活率,进一步提高2,5-DMP产量。最后,通过阻断合成2,5-DMP的支路代谢途径,可以显著减少副产物积累,增加2,5-DMP产量,同时提高L-苏氨酸转化率。最终获得的重组菌EcΔkΔAΔBΔA/TDHEcNoxELc-PSst T在含有5 g/L L-苏氨酸的转化体系中于37℃、200 r/min孵化24 h,可积累(1095.7±81.3)mg/L的2,5-DMP,L-苏氨酸转化率达到76%,产物得率为0.288 g/(g L-苏氨酸)。因此,文中构建的重组菌可以实现高效催化L-苏氨酸合成2,5-DMP,具有一定的工业应用潜力。

摘要：中科院微生物所陶勇课题组在大肠杆菌中表达青霉素扩环酶（DAOCS）,利用全细胞催化高效转化青霉素G生成G-7-ADCA。该研究通过对大肠杆菌初级代谢网络的精巧设计,重构TCA并偶联生物合成反应,实现高效的生物转化。展示了通过重构的TCA循环来推动目标酶促反应的可能性。

摘要：试验旨在探究微生物合成Levan果聚糖的新途径并优化其合成条件。利用转入果聚糖蔗糖转移酶基因的重组谷氨酸棒状杆菌进行全细胞催化合成Levan果聚糖,并采用响应面法以Levan果聚糖产量为响应值优化催化合成条件。首先设计Plackett-Burman试验从7个相关因素(蔗糖浓度、菌体浓度、转化时间、转化pH、PBS中Ca^2+和Mg^2+浓度、Levan果聚糖提取时的乙醇终浓度)中筛选出影响Levan果聚糖产量的3个主要因素(蔗糖浓度、乙醇终浓度和Ca^2+浓度);再用筛选出的3个最重要因素进行最陡爬坡试验逼近最大响应值区域;最后运用BBD响应面法优化确定3个主要因素之间的交互作用和最佳合成条件。结果显示,初始试验中Levan果聚糖平均产量为0.069 g/mL。经过响应面试验优化对利用重组谷氨酸棒状杆菌进行全细胞催化合成Levan果聚糖产量影响最大的因素为蔗糖浓度,其次为提取时的乙醇终浓度,最后是转化液中的Ca^2+浓度。当蔗糖浓度为52.71%、乙醇终浓度为85.31%、Ca^2+浓度为0.04 g/L时,利用重组谷氨酸棒状杆菌进行全细胞催化合成的Levan果聚糖产量平均值为0.238 g/mL,与模型预测最大值0.233 g/mL相近,转化率约为44%,转化率较初始试验提高了约1.9倍,产量亦较初始试验提高了约3.4倍。研究结果为Levan果聚糖工业化生产提供了依据,并为其在动物医学和营养方面的研究奠定基础。

摘要：二元胺是聚酰胺、聚氨酯和聚脲等高分子材料合成的核心单体,生产需求巨大。在碳中和大背景下,合成生物基二元胺是实现低碳生产和可持续发展的有效途径,借助合成生物学、代谢工程、蛋白质工程等策略能够设计和开发高效的二元胺生物合成关键酶和途径。本工作简述了1,4-丁二胺、1,5-戊二胺、1,6-己二胺的天然或人工合成路径,围绕微生物从头合成发酵和全细胞催化两种合成策略综述了二元胺的合成进展,丁二胺的生物合成主要包括鸟氨酸脱羧与赖氨酸脱羧路径,目前主要以发酵法生产丁二胺,但丁二胺的产率较低,不能达到工业生产的需求;戊二胺的生物合成路径为赖氨酸脱羧,主要采用发酵法和全细胞催化法,其中全细胞催化合成戊二胺更为高效,技术趋于成熟,已被广泛应用于规模化生产;己二胺目前主要是通过构建人工途径进行生物合成。另外,针对二元胺生物合成过程遇到的副产物多、菌株活性差、产率低、分离纯化困难等问题与挑战,提出了结合代谢工程和蛋白质工程优化关键酶催化、探索二元胺积累造成细胞损伤的影响机制、增强酶催化专一性和活性以提高生产强度、优化发酵体系、简化后续分离纯化步骤等提高生物合成二元胺的方法,同时指明了未来生物基二元胺工作的重要方向并展望了生物基二元胺的发展前景。

摘要：本文以重组大肠杆菌E. coli BL21(DE3) p ET30α(+)-Nmnat为研究对象,考察化学通透剂处理重组菌对其催化合成NADP的影响。实验显示,在单因素筛选实验中,四种通透剂曲拉通X-100、吐温80、二甲基亚砜和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对细胞进行通透化处理均可提高全细胞催化产率,且提高幅度差距并不显著。进一步采用析因设计考察四种通透剂的复合效应,除了曲拉通X-100与吐温80和曲拉通X-100与CTAB交互作用的P大于0. 05为不显著,其余所有交互作用项P值均小于0. 05,呈现显著性,且复合通透剂中,仅单一增加CTAB量,复合体系的协同作用将减少,制约作用增加,不适宜用于复合配方。最后采用中心组合设计进一步对复配效果进行优化,通过拟合得到最佳通透剂配比为曲拉通X-100(1. 64%),吐温80(2. 53%)以及二甲基亚砜(1. 06%),此时NADP预测产率达到77. 46%,与实际验证产率均值77. 05%相差甚微,说明实验优化模型具有良好预测性,优化结果与未添加通透剂相比提升近47%,表明优化复合通透剂配方更有利于提高重组菌催化合成NADP。

摘要：α-熊果苷是一种高价值糖苷,在化妆品和制药行业具有广泛的应用前景。酶法是生产α-熊果苷的主要手段,但由于缺乏高催化效率的酶而限制了α-熊果苷的生产。为了提高来自Streptococcus mutans UA159的蔗糖磷酸化酶(SmSP)的生物转化效率,进而提高α-熊果苷的产量,筛选了4种在Bacillus subtilis WB600中表达SmSP的载体,其中重组质粒pP43NMK-P43-gtfA在全细胞转化20 h后获得了最高的α-熊果苷产量(40.2 g/L)。其次,对SmSP催化活性中心周围的loop A进行了定点饱和突变,以提高酶和受体之间的亲和力,得到了突变体SmSP^I336L,其α-熊果苷产量和底物对苯二酚(hydroquinone,HQ)摩尔转化率分别为71.7 g/L和72.4%,产量相比对照提高了78.4%。最后,对重组菌株*** WB600/pP43NMK-P43-SmSP^I336L全细胞转化合成α-熊果苷反应条件进行优化,α-熊果苷的产量达到了110.3 g/L,HQ摩尔转化率为88.7%,产量相比对照提高了2.74倍。高催化效率重组菌株的构建,以及对突变体动力学的分析,对生物转化合成α-熊果苷具有重要的研究意义和应用价值。

摘要：本研究以重组大肠杆菌*** BL21(DE3)pET30α(+)-Nmnat为对象,采用析因设计考察复合通透剂对重组菌全细胞催化合成NAD的影响。结果显示,当甲苯、曲拉通X-100、二甲亚砜和吐温80作为单一通透剂作用时,其质量分数分别为1%、1.5%、2%和0.5%时更利于重组细胞催化合成NAD。进一步采用析因设计考察通透剂的复合效应,方差分析显示四种通透剂单因子及部分多元因子交互作用均对响应值具有显著影响。多元线性回归模型结果显示不同单因子和交互因子对响应值存在一定的制约或协同作用,表明复合通透性的改变是通透剂多重作用的结果。根据模型拟合并优选出最佳的复合通透剂组合为,0.5%甲苯、2%曲拉通X-100、1.5%二甲亚砜以及0.5%吐温80,并进行实验验证,其催化生成NAD的产率与单一通透剂相比提升近44%左右,证明析因设计得到的实验模型预测性良好且预测得到的复合通透剂配方更有利于提高重组菌催化合成NAD。