摘要：根据牛疱疹病毒1型(BHV1)gB基因序列,设计高度保守的引物和荧光探针,并扩增包含有荧光PCR扩增区域的核酸片段,通过凝胶纯化回收,将该片段克隆至pMD18-T载体,经鉴定后获得目标模板。通过碱基重排和引物设计,用搭桥法PCR扩增,获得BHV1荧光定量PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了含有内标物的荧光定量PCR检测体系。该体系可以检测到10个拷贝/PCR反应的重组质粒,对BHV1可检测到0.01TCID50的病毒粒子,灵敏度比常规PCR和病毒分离高10～100倍,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当。更重要的是,内标模板可以对反应体系进行监测,指示并校正假阴性结果,从而达到提高PCR检测准确率的目的。对临床收集的40份牛精液(其中8份已经鉴定为阳性)和10份牛鼻腔拭子(其中2份已经鉴定为阳性)用该体系进行检测,均得到预期结果。该方法的建立可用来对临床样品中BHV1的快速检测和实验室的质量控制。

摘要：为建立同步检测布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体的双重PCR方法,根据GenBank上公布的布鲁氏菌Bp26基因和贝纳氏柯克斯氏体IS1111a基因,利用Primer premier 5.0软件各设计一对特异性引物,分别扩增出219 bp和130 bp的目的片段,通过优化PCR反应体系和扩增条件,建立起了能够同步快速检测布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体的双重PCR方法,该方法具有较好的特异性、可重复性和较高的灵敏性。利用该双重PCR方法对流产牛抗凝全血、血清、流产胎儿及奶液等172份临床样品进行检测,共检测到布鲁氏菌感染阳性样品53份,贝纳氏柯克斯氏体感染阳性样品10份,混合感染阳性样品2份,阳性检出率分别为30.8%、5.8%、1.2%。初步临床应用结果表明,该方法可用来安全、同步、快速、灵敏地对布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体进行检测。

摘要：为了建立同步检测奶牛布鲁菌、鹦鹉热衣原体和贝纳氏柯克斯氏体感染的多重PCR方法,根据GenBank上具有属间特异性的布鲁菌.Bp26基因、鹦鹉热衣原体23S rRNA基因和贝纳氏柯克斯氏体IS1111a基因,利用Primer premier 5.0软件各设计1对特异性引物。通过优化PCR反应体系和扩增条件,建立了能够同时检测奶牛布鲁菌、鹦鹉热衣原体和贝纳氏柯克斯氏体的多重PCR方法。该方法具有较好的特异性和可重复性,对3种基因单重PCR检测敏感性均达到3.1×10~2拷贝·反应^-1,对3种病原基因同步检测的敏感性能达到3.1×10~3拷贝·反应^-1。利用该方法对采自不同流产牛的抗凝全血、血清、流产胎儿及奶液等172份临床样品进行检测,检测到布鲁菌感染阳性样品53份,鹦鹉热衣原体感染阳性样品2份,贝纳氏柯克斯氏体感染阳性样品10份,且检测到布鲁菌和鹦鹉衣原体混合感染阳性样品2份,布鲁菌和贝纳氏柯克斯氏体混合感染阳性样品2份,尚未检测到3种病原混合感染的阳性样品。结果表明,建立的多重PCR方法可以用来对奶牛布鲁菌、鹦鹉热衣原体和贝纳氏柯克斯氏体进行同步、快速、灵敏的检测。

摘要：为建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV）内标双重TaqMan荧光RT-PCR方法,本研究根据BVDV 5＇-UTR区序列设计引物和荧光标记探针,通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）扩增获得内标模板,经体外转录得到可以作为内标物的cRNA。经反应条件的优化,建立了BVDV内标双重TaqMan荧光RT-PCR检测体系。结果表明：当cRNA浓度为103拷贝/μL时,二者均有较好的扩增曲线;该方法对I型BVDV的检测灵敏度为0.25 TCID50,对II型BVDV的检测灵敏度为2.5 TCID50;利用该方法对猪瘟病毒等其他相关核酸的检测结果均为阴性;重复性检测Ct值变异系数为0.54~4.73。对506份临床样品检测,结果有23份样品为阳性,阳性样品检出数量和编号与不含内标的单一荧光RT-PCR方法完全一致,表明该方法可以用来对BVDV进行准确、快速检测,并且可以对检测结果进行质量监控。

摘要：为了对BVDV-1和BVDV-2进行同步检测,针对不同基因型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因组高度保守的5′-UTR核苷酸序列设计特异性引物(扩增长度为288bp)。为了指示假阴性结果,以牛GAPDH基因为内标基因,设计特异性引物(扩增序列长度为152bp)。通过反应条件的优化,建立了BVDV通用型内标双重RT-PCR检测方法,该方法可以监测RNA提取与RT-PCR反应过程,指示假阴性结果的发生。该方法的检测灵敏度约为100TCID50/mL,且具有较好的特异性和可重复性。通过对566份临床样品检验,检测到阳性样品19份,阳性率3.36%。该方法可用于临床样品中BVDV检测,并可对检测结果进行质量控制。

摘要：本试验以牛新孢子虫NcSAG1基因、Nc-5基因和NcSRS2基因作为检测新孢子虫病的目的基因,以牛性腺(prolac-tin)基因作为内标对反应过程进行监测,对上述基因各设计1对引物。结果表明,4对引物可分别扩增出201bp、231bp、256bp和156bp的目的条带。经反应条件的优化,该方法具有较好的灵敏度,各质粒在103 copies/反应时,均可于同一管中扩增出较清晰的目的条带,只比单重PCR的灵敏度低了10倍,且不受内标模板存在的影响。经临床应用研究,该方法具有较好的特异性和重复性,可用来对新孢子虫进行快速准确的检测。

摘要：为建立同时检测布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体的双重PCR方法,本研究据GenBank上已发表的具有属间特异性的布鲁氏菌bp26基因和鹦鹉热衣原体23SrRNA基因,利用Primer Premier 5.0软件各设计1对特异性引物,扩增的目的片段长度分别为219和356bp。通过优化反应条件,建立了能同时检测布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体的双重PCR方法。该方法具有较好的特异性和可重复性,对2种基因单重PCR检测敏感性均达到3.1×102拷贝/反应,双重检测的灵敏度为3.1×103拷贝/反应。利用该双重PCR方法对流产牛抗凝全血、血清、流产胎儿及奶液共172份临床疑似布鲁氏菌感染的样品进行检测,检测到布鲁氏菌阳性样品53份,鹦鹉热衣原体阳性样品2份,以上这2种病原的阳性检出率分别为30.8%和1.2%,且检测到2种病原混合感染的阳性样品2份,阳性检出率为1.2%。临床应用结果表明,该方法可用来对布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体进行同步、快速、灵敏的检测。

摘要：根据GenBank已发表的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因Ⅰ型和Ⅱ型5’端非编码区(5’-UTR)保守序列,设计两对针对基因Ⅰ型和Ⅱ型的特异性引物,经反应条件的优化,建立了在同一反应体系中同时检测BVDV基因Ⅰ型和Ⅱ型的RT-PCR方法。该方法对两个基因型的病毒检测灵敏度均为2TCID50,只比单重PCR的灵敏度低了10倍。且具有较好的特异性和可重复性。经临床应用验证,该方法可用来对两个基因型的BVDV进行同步分型检测。