摘要：目的设计新型血浆外参照(plasma external reference,PLACON),用于人类血浆mRNA、miRNA的检测分析。方法从低级别物种秀丽隐杆线虫基因组中选取一段保守序列,利用BLAST检索PLACON序列的特异性,设计成为新型血浆外参照。以恶性肿瘤患者血浆样品及癌细胞株上清液,利用实时荧光定量PCR法,在血浆或细胞上清液中分别以PLACON、β-actin、GAPDH、U6为参照,检测血浆mRNA、miRNA和细胞上清液mRNA并进行对比分析。结果 BLAST检索出PLACON序列具有较好的特异性,与人类基因组无交叉性。熔解曲线均显示RT-qPCR反应特异性较高,PLACON在血浆中mRNA水平扩增的循环阈值(cycle threshold,CT)均显著低于GAPDH、β-actin(P<0.01),在血浆中miRNA水平扩增的CT值显著低于U6(P<0.01)。PLACON在癌细胞上清中进行mRNA扩增实验的验证,得到相似的结果。结论 PLACON序列特异性好,在血浆中比内参照更有优势,稳定性更高,扩增效率更高,可用于血浆mRNA、miRNA的定量检测。

摘要：根据柑桔衰退病毒(CTV)P20基因序列设计cquctv9/cquctv10特异引物对,以柑桔RNApolymeraseⅡ基因作为内参照,建立了柑桔衰退病的常规RT-PCR快速检测体系;依据柑桔衰退病毒P20基因序列设计cquctv1/cquctv2特异引物对和TaqMan探针cquctvp1,建立了柑桔衰退病荧光定量RT-PCR快速检测体系。常规RT-PCR检测下限是含有CTV的50pg总RNA,荧光定量RT-PCR法的检测下限是2fg纯CTV片段。荧光定量RT-PCR的灵敏度相对比常规RT-PCR高100倍。利用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR体系对从2005年3月到2006年7月采自田间的样品进行检测,结果表明,2种检测体系都有很好的特异性和准确性;对183个田间柑桔苗木样品带毒率检测结果表明,荧光定量RT-PCR检出率为(82.5%),比常规RT-PCR检出率(73.2%)高。

摘要：基于国际生命条码联盟(CBOL,the Consortium for the Barcode of Life)提出的barcoding技术所确定的序列区域,针对猪的线粒体COⅠ基因序列设计特异性引物。为了避免食品中PCR抑制剂的影响,本实验设置GCG(胰岛素受体)基因125bp的纯化片段为内参照,控制假阴性结果的出现。通过优化PCR反应条件,猪和GCG基因的特异性产物在79.2℃和75℃有特异性熔解峰。设置牛、羊、鸡、兔、鼠和空白对照,均无扩增。测序结果表明,该猪特异性引物的PCR产物含有245bp的核苷酸序列与GenBank中相应序列吻合;该方法检出限为0.001%。

摘要：根据鸡线粒体DNA细胞色素b基因序列和内参照基因PUC18质粒基因序列设计特异性引物和以不同荧光素标记的TaqMan探针。通过对反应条件的优化筛选,建立能同时扩增鸡源性成分和内参照基因成分的双重实时荧光PCR检测方法。设置内参照反应是为了监控反应体系中是否含有PCR反应的抑制物,避免出现假阴性结果。分别以鸡、鸭、鹅、火鸡、牛、羊、猪、鱼、兔、驴、鹿、狗、马、鸽子、大豆、玉米、小麦、大米、马铃薯及番茄的线粒体DNA作为模板进行特异性试验,结果表明该方法仅能特异性扩增鸡源性成分,而对其它物种未见有效扩增。通过灵敏度测试,该方法检出限达0.01%。所制定的方法特异性高,灵敏度好,可以作为食品和饲料中鸡源性成分的高效检测方法。