摘要：背景:平滑肌细胞增殖移行和血小板激活导致血栓形成是移植血管再狭窄的主要原因,一氧化氮可以抑制上述生物反应,但内皮型一氧化氮合酶基因转染是否可以抑制种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生还未得到证实。目的:拟进一步观察内皮型一氧化氮合酶基因转染对种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生的影响。设计、时间及地点:重复观察测量,于2006-04/2007-05在西安交通大学医学院中心实验室及分子生物学实验室完成。材料:1月龄新西兰大白兔1只,用来获取平滑肌细胞。成年新西兰大白兔18只,随机分成3组,正常对照组植入未转染的人工血管,LacZ转染组植入种植转染lacZ的平滑肌细胞的人工血管,内皮型一氧化氮合酶转染组植入种植内皮型一氧化氮合酶的平滑肌细胞的人工血管,6只/组。方法:构建含有报道基因lacZ和内皮型一氧化氮合酶基因的假型反转录病毒载体小鼠白血病病毒/疱疹性口炎病毒G糖蛋白,并转染平滑肌细胞。将转染了基因的细胞种植在人工血管上,并用血管旁路移植的方法植入兔腹主动脉。主要观察指标:瓜氨酸法检测细胞培养上清中一氧化氮含量。移植血管内膜X-gal染色观察,种植的平滑肌细胞为蓝色,而内源性细胞为红色。显微镜下测量血管内膜增生厚度。结果:18只兔均进入结果分析。内皮型一氧化氮合酶转染组一氧化氮含量明显高于正常对照组(P0.05);植入100d,正常对照组与内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度基本相似(P>0.05),两组明显均低于lacZ转染组(P<0.05)。结论:内皮型一氧化氮合酶基因转染可抑制种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生。

摘要：目的探讨内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因第7外显子G 894 T(Glu 298 Asp)变异与年龄、吸烟之间交互作用在冠心病患病中的意义。方法用病例—病例研究设计,以新诊断的冠心病患者为研究对象,用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)检测eNOS基因G 894 T变异,运用单因素及多因素Logistic回归分析eNOS基因G 894 T变异与年龄、吸烟之间的交互作用。结果eNOS基因G 894 T变异与年龄之间在冠心病的患病中存在显著的相乘模型交互作用,且该交互作用具有显著的剂量-反应关系;eNOS基因G 894 T变异与吸烟之间在冠心病的患病中无显著的相乘模型交互作用,其交互作用也无显著的剂量-反应关系。结论eNOS基因G 894 T变异可增加低年龄者冠心病的患病的患病危险性;且年龄越低,eNOS基因G 894 T变异对冠心病的患病危险性越高。

摘要：背景:内皮型一氧化氮合酶表达产物对内皮细胞的影响是血管外科基础研究中的重要课题,对于生物人工血管的研制有重要意义。目的:构建内皮型一氧化氮合酶基因真核表达载体pcDNA3.1/eNOS,以脂质体为介导观察其在血管内皮细胞中的转染效率,评价表达产物内皮型一氧化氮合酶的酶学活性及其对内皮细胞生长的影响。设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2005-07/2007-05在南京大学医学院附属鼓楼医院生物化学实验室完成。材料:质粒PCMV-eNOS由勋阳医学院张群林教授惠赠。pcDNA3.1真核表达载体由南京大学博士后贾立军馈赠,pcDNA3.0/EGFP质粒由戚金亮博士提供。大肠杆菌DH5a和人脐静脉内皮细胞株(ECV304)为南京大学生物系保存。方法:采用分子生物学技术,先用限制性核酸内切酶EcorⅠ酶切质粒PCMV/eNOS,电泳回收3.6kb编码人内皮型一氧化氮合酶cDNA序列,克隆入质粒pcDNA3.1的EcorⅠ酶切位点,通过内皮型一氧化氮合酶cDNA序列中的XhoⅠ酶切位点筛选其插入载体的方向,构建pcDNA3.1/eNOS重组质粒。以Lipofec-tamine为介导将其与pcDNA3.0/EGFP共转染分离培养的人脐静脉内皮细胞(ECV304)。主要观察指标:①观察转染后对ECV304生长的影响,在流式细胞仪和荧光显微镜下计算转染效率。②以反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学检测内皮型一氧化氮合酶基因的表达,测定内皮型一氧化氮合酶活性以及一氧化氮产量。③观察施加不同因素(L-精氨酸、氯化钙、乙二胺四乙酸、L-NAME)对内皮型一氧化氮合酶活性及一氧化氮合成的影响;同时检测此时ECV304生长所受影响。结果:以脂质体为介导转染人脐静脉ECV304后,其转染效率为(32.6±2.6)%,反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学检测到相应的内皮型一氧化氮合酶mRNA和蛋白表达,与对照组有明显差别;同时在上述不同因素影响下内皮型一氧化氮合酶活性出现明显差别;随着培养液一氧化氮浓度升高,ECV304生长曲线下降。结论:成功构建pcDNA3.1/eNOS,在脂质体介导下能高效转染ECV304并良好表达,Ca2+是内皮型一氧化氮合酶的必要激活条件,ECV304的增生受到高浓度一氧化氮抑制。

摘要：背景：大量的研究结果已证实，内皮细胞如能够早期覆盖受损的血管内膜层，则可避免血管内再狭窄的发生。目的：通过与西药作用对比，观察中药桃核承气改良方对兔血管损伤后内皮细胞生长及功能的影响。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2007—04／11在辽宁中医药大学和中国医科大学完成。材料：健康新西兰大耳白兔40只，体质量2．0～2．5kg，高酯饲料喂养4周行腹主动脉内膜剥脱造模，制备动脉粥样硬化模型。桃核承气改良方为辽宁中医药大学附属第一医院制剂产品；舒降之为杭州默沙东制药有限公司产品；阿司匹林为拜尔药业集团有限公司产品。方法：40只兔随机数字表法分为4组。造模后模型组、中药组、西药组正常饲料喂养，中药组予桃核承气改良方13．5mL／kg灌胃4周，西药组予舒降之、阿司匹林混合液13．5mL／kg灌胃4周，模型组、空白组予生理盐水13．5mL／kg灌胃4周。主要观察指标：①造模后1，28d采用硝酸还原法法和比色法测定血浆内皮素1、血清一氧化氮含量。②免疫组织化学法测定血管中内皮素1、内皮型一氧化氮合酶蛋白表达。结果：32只新西兰大耳白兔进入结果分析，模型组（n=8）、中药组（n=10）、两药组（n=8）和空白组（n=6）。①与空白组相比，其他3组造模后1d血浆内皮素1升高，血清一氧化氮含量下降（P〈0．05）。造模后28d兔中药组、西药组血浆内皮素1较模型组明显降低，血清一氧化氮明显升高（P〈0．05）。②血管中内皮素1表达模型组明显高于其他3组（P〈0．05）；中药组、西药组较模型组显著减弱（P〈0．05）。模型组内皮型一氧化氮合酶表达明显低于其他3组（P〈0．05）；中药组、西药组较模型组显著增强（P〈0．05）。结论：桃核承气改良方能够促进内皮素与一氧化氮之间的平衡协调，有利于血管内皮细胞的修复。

摘要：背景:β-肾上腺素能受体激动可增加内皮型一氧化氮合酶活性的细胞信号转导通路,对于揭示β-肾上腺素能系统调控血管张力的生理学机制有重要价值,既往实验显示异丙肾上腺素激活内皮型一氧化氮合酶与内皮型一氧化氮合酶蛋白磷酸化有关。目的:探讨β-肾上腺素能受体激动增加人脐静脉内皮细胞内皮型一氧化氮合酶活性信号转导通路中可能涉及的蛋白激酶。设计:对比观察。单位:郑州大学第一附属医院老年病科。材料:实验于2006-09/2007-06在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。实验材料为郑州大学第一附属医院妇产科住院的健康顺产或剖宫产患者自愿捐献的新生儿无血肿、夹痕的脐带。所有患者对实验均知情同意,实验方案经医院伦理委员会批准。主要试剂:β-肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素、磷脂酰肌醇3激酶抑制剂(Wortmannin)、蛋白激酶A抑制剂(H-89)、3H-L-arginine(美国SIGMA公司)。方法:设置空白对照组、H-89组、Wortmannin组及H-89+Wortmannin组,每组因素下再分异丙肾上腺素及空白对照两个干预因素组,每小组三复管。观察H-89和Wortmannin分别与人脐静脉内皮细胞孵育10min,再与异丙肾上腺素孵育30min后内皮型一氧化氮合酶活性变化。同位素二步色谱法测定3H-L-citrulline的产量反映内皮型一氧化氮合酶活性。人脐静脉内皮细胞上3H-L-citrulline的产量相对空白对照组以百分比形式表达。主要观察指标:各组内皮型一氧化氮合酶活性变化。结果:①内皮型一氧化氮合酶基础活性为每微克蛋白(3085.62±272.72)mBq,与空白对照组比较,异丙肾上腺素可明显增加内皮型一氧化氮合酶活性(30.72±3.91)%(P0.05)。②预先加入H-89及Wortmannin后再加入异丙肾上腺素,可见异丙肾上腺素增加内皮型一氧化氮合酶活性的作用受到明显抑制(4.73±2.19)%,(17.35±3.72)%(P0.05)。结论:β-肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素能激活内皮型一氧化氮合酶活性的信号通路,在此过程中蛋白激酶A及磷脂酰肌醇3激酶均有参与。

摘要：目的探究负压微环境对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)新生的影响及其机制。方法采用实验研究方法。取第3~5代对数生长期HUVEC进行后续实验。取3批细胞,各批次细胞均分为常规培养24 h的正常对照组和单纯负压处理组以及加入17-丙烯胺基-17-去甲氨基格尔德霉素(17-AAG)培养24 h的单纯17-AAG组与17-AAG+负压处理组,另采用自行设计研发的全自动三维细胞梯度负压加载装置对2个负压处理组细胞行持续8 h的间歇负压吸引(负压值为-5.33 kPa,吸引30 s、暂停10 s),第1个批次细胞处理完成后于培养0(即刻)、24、48、72 h,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖水平,样本数为6;第2个批次细胞处理完成后进行划痕试验,于划痕后12 h,在倒置相差显微镜下观察细胞迁移情况后计算细胞迁移率,样本数为3;第3个批次细胞处理完成后进行小管形成实验,于培养6 h,在倒置相差显微镜下观察成管情况后计算细胞成管总长度与分支节点数,样本数为3。取细胞,分为正常对照组、单纯负压处理组、17-AAG+负压处理组,同前相应组别进行处理,处理完成后,采用蛋白质印迹法检测细胞中热休克蛋白90(HSP90)、窖蛋白1、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、eNOS磷酸化位点1177蛋白表达并计算eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值(样本数为3),采用免疫共沉淀(共沉淀HSP90与窖蛋白1、窖蛋白1与eNOS)与蛋白质印迹法检测各组细胞中窖蛋白1、eNOS的蛋白表达(样本数为3),采用免疫荧光双重染色法评估细胞中HSP90与窖蛋白1、窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位情况。通过HADDOCK 2.4蛋白质-蛋白质对接程序对窖蛋白1和eNOS进行分子对接预测。数据分析采用析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD法。结果与正常对照组相比,单纯17-AAG组细胞增殖水平于处理完成后培养24、48、72 h均明显降低(P0.05);单纯负压处理组细胞中HSP90蛋白表达与eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值均明显高于正常对照组(P<0.01),17-AAG+负压处理组细胞中HSP90蛋白表达与eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值均明显低于单纯负压处理组(P<0.01)。处理完成后免疫共沉淀与蛋白质印迹法检测显示,与正常对照组相比,单纯负压处理组细胞中窖蛋白1蛋白表达明显升高(P<0.01),eNOS蛋白表达明显降低(P<0.05);与单纯负压处理组相比,17-AAG+负压处理组处理完成后细胞中窖蛋白1蛋白表达明显降低(P<0.01),eNOS蛋白表达明显升高(P<0.01)。处理完成后,与正常对照组相比,单纯负压处理组细胞中HSP90与窖蛋白1的蛋白共定位明显增多,窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位明显减少;与单纯负压处理组比,17-AAG+负压处理组细胞中HSP90与窖蛋白1的蛋白共定位明显减少,窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位明显增多。分子对接预测提示,窖蛋白1与eNOS相互作用较强,抑制eNOS 1177位点的磷酸化。结论负压微环境可能通过促进HUVEC中HSP90结合窖蛋白1进而抑制窖蛋白1结合eNOS,以解除窖蛋白1对eNOS 1177位点磷酸化的抑制,从

摘要：背景:导致血管内皮细胞损伤的因素中,肾素-血管紧张素系统、尤其是局部肾素-血管紧张素系统所产生的血管紧张素Ⅱ起着重要的病理生理作用。目的:观察丹参酮ⅡA对血管紧张素Ⅱ作用下的血管内皮细胞分泌一氧化氮及其内皮型一氧化氮合酶基因表达的影响和细胞内游离钙离子浓度水平的改变,探讨丹参酮ⅡA对血管内皮细胞的保护作用。设计:观察对比实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊内科。材料:实验于2006-03/10在华中科技大学同济医学院基础医学实验中心完成。实验用猪主动脉由同济医学院病理生理教研室提供。方法:采用硝酸还原法、逆转录聚合酶链反应,分别检测不同浓度(10-8～10-6mol/L)作用不同时间(1,6,24h)的血管紧张素Ⅱ对培养的猪主动脉内皮细胞产生一氧化氮及其内皮型一氧化氮合酶mRNA表达的影响;然后比较在10-6mol/L的血管紧张素Ⅱ作用的不同点(0,6h)加入50mg/L浓度的丹参酮ⅡA,分别检测作用1,6,24h后内皮细胞的一氧化氮生成和内皮型一氧化氮合酶的基因表达变化。用激光共聚焦扫描显像系统检测内皮细胞内游离钙离子浓度水平的变化。主要观察指标:①一氧化氮含量。②内皮型一氧化氮合酶mRNA表达。③游离钙离子浓度。结果:①随着血管紧张素Ⅱ浓度的增加、作用时间的延长,内皮细胞一氧化氮的产生及内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达呈顺序下降(P0.05)。③主动脉内皮细胞游离钙离子浓度:血管紧张素Ⅱ组显著高于空白对照组(P<0.01),丹参酮+血管紧张素Ⅱ组显著低于血管紧张素Ⅱ组(P<0.05)。结论:丹参酮ⅡA可抑制血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞分泌一氧化氮以及细胞内皮型一氧化氮合酶基因表达的负性作用,可能通过多种途径对血管内皮细胞及其功能起到保护作用。

摘要：目的探讨内皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)基因多态性与冠心病、吸烟的关系。方法依据eNOS基因外显子7G894T位点设计引物,通过巢式聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,限制性内切酶消化目的片段,琼脂糖凝胶电泳,紫外透射分析仪检测,计数117例CAD患者和有吸烟的CAD患者及100例健康者基因型及突变基因频率,通过χ2检验有无统计学意义。结果eNO基因外显子7的894位点有3种基因型:GG、GT、TT。CAD组117例中31例发生G894T突变,纯合子TT3例,杂合子GT28例。对照组100例中15例发生G894T突变,均为杂合子。CAD组基因突变频数明显高于对照组,两组GT+TT型χ2检验结果:χ2=4.265P<0.05,等位基因频数χ2=5.321,P<0.05。吸烟比例在CAD组明显高于对照组χ2=17.921,P<0.01。另外,基因突变频数在CAD吸烟组明显高于CAD非吸烟组χ2=4.966,P<0.05。结论eNOS基因894位点G→T突变与吸烟和CAD发病密切相关。

摘要：目的探讨营养性肥胖对SD大鼠睾丸间质细胞内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和精原细胞增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响。方法选用出生后3周雄性SD大鼠23只,随机分为对照组（普通饲料喂养）和营养组（自制的营养性饲料喂养）,分别于喂养后第1~5周末测量大鼠体质量、体长,计算Lee’s指数,喂养5周后以营养组致肥成功大鼠8只为肥胖组,继续喂养4周后,打击头部处死,睾丸做石蜡切片,免疫组化染色,并与对照组比较。结果喂养9周后,肥胖组大鼠睾丸间质细胞eNOS阳性表达增强,PCNA阳性精原细胞数明显减少（P〈0.05）。结论营养性肥胖对雄性SD大鼠的生殖发育产生了影响,可能与睾丸间质细胞NOS和精原细胞PCNA的表达改变有关。

摘要：目的探讨内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因5’侧翼区T-786C多态性与中国汉族人冠心病和冠状动脉狭窄支数的关系。方法依据eNOS基因5’侧翼区T-786C位点设计引物，应用多聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析方法检测136例经冠状动脉造影证实的冠心病（冠心病组）和77例非冠心病（对照组）患者的eNOS基因T-786C多态性。结果（1）冠心病组TT＋TC和CC基因型频率分别为72．8％、25．7％、1．5％，对照组分别为92．2％、6．7％、0（χ^2=11．5，P〈0．01）；（2）冠心病组C等位基因的频率高于对照组C等位基因的频率（14．3％比3．9％，χ^2=11．5，P〈0．01）；（3）多元logistic回归显示eNOS T-786C基因多态性是冠心病的独立危险因素（OR值5．261，95％CI：2．010～13．768）；（4）在1、2、3支冠脉血管狭窄组中。TC＋CC基因型频率分布分别为21．4％、25．0％和33．3％（χ^2=1．83，P〉0．05），C等位基因频率分别为10．7％、12．5％、18．5％（χ^2=2．66，P〉0．05）。结论（1）eNOS T-786C基因多态性是冠心病的遗传危险因素，并独立于冠心病其它的经典危险因素；（2）eNOS T-786C基因多态性与冠脉狭窄的支数元关。