摘要：背景:多项研究已证实神经干细胞能促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,但其分子机制还不清楚。目的:观察神经干细胞移植对脊髓全横断损伤大鼠大脑运动皮质相关凋亡基因Bax,Bcl-2和Caspase-3mRNA表达的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-07/2008-12在昆明医学院神经科学研究所完成。材料:孕14～15d绿色荧光蛋白转基因鼠5只,取其胚胎用于神经干细胞培养。清洁级健康成年雌性SD大鼠88只,随机分成3组:假手术组8只、模型组40只、细胞移植组40只。方法:模型组、细胞移植组大鼠建立T9脊髓全横断脊髓损伤模型,假手术组只行T8椎板切除。用DMEM/F12调整胎鼠神经干细胞密度为2×1010L-1,吸取细胞悬液15μL滴加到约2mm3大小的明胶薄片上,细胞移植组将此明胶薄片植入大鼠脊髓两横断面之间的间隙处。分别于细胞移植后3,7,14,21,28d取材进行指标检测。主要观察指标:RT-PCR法检测大脑运动皮质Bax,Bcl-2和Caspase-3mRNA表达的变化。结果:与假手术组比较,模型组各时间点Bax的表达均无明显差异(P>0.05),术后14,28dBcl-2的表达明显减少(P<0.05),术后3dCaspase-3的表达明显升高(P<0.05)。与模型组比较,细胞移植组在神经干细胞移植后3dBax的表达明显减少(P<0.05),移植后14,21dBcl-2的表达明显增高(P<0.05),移植后3,7dCaspase-3的表达明显减少(P<0.05)。结论:神经干细胞移植后,可能通过调控大脑运动皮质相关凋亡基因Bax,Bcl-2和Caspase-3mRNA的表达促进大鼠全横断脊髓损伤修复。

摘要：目的研究p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因沉默对大气细颗粒物(PM2.5)染毒肝细胞(L02细胞)相关基因表达的影响。方法于2019年6至9月,根据GenBank提供的p38MAPK基因序列,设计合成3条干扰序列,退火后连接到PLVX-shRNA2-puro中,将重组慢病毒载体转染L02细胞。用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting)法对p38MAPK基因沉默效果进行鉴定。用浓度为50μg/ml的PM2.5水溶物和10μmol/L阳性对照Cr^6+分别染毒L02细胞、p38MAPK基因沉默细胞24 h,同时设立空白对照组。用荧光定量PCR检测癌基因(c-fos、c-myc、k-ras)、抑癌基因(p53)和凋亡基因(Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)的相对表达水平。结果p38MAPK基因沉默细胞中p38MAPK基因和蛋白表达水平较正常L02细胞明显下降(P<0.05),p38MAPK基因沉默细胞株构建成功。与空白对照组比较,PM2.5染毒L02细胞组癌基因c-fos、c-myc、k-ras和凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达水平升高,抑癌基因p53表达水平下降,差异均有统计学意义(P<0.05);与PM2.5染毒L02细胞组比较,PM2.5染毒p38MAPK基因沉默细胞组癌基因c-fos、c-myc、k-ras和凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达水平下降,抑癌基因p53表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论PM2.5对L02细胞癌基因、抑癌基因和凋亡基因表达有明显影响,而p38MAPK基因沉默可抑制PM2.5对L02细胞的影响。

摘要：目的构建c-myc基因沉默肝细胞株,研究c-myc基因沉默对PM2.5染毒L02肝细胞凋亡基因和癌基因表达的影响。方法根据GenBank提供的c-myc基因mRNA序列,设计合成3条干扰序列,将重组慢病毒载体转染L02肝细胞。利用实时荧光定量PCR(Q-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blotting)对c-myc基因沉默效果进行鉴定。用L02肝细胞、c-myc基因沉默细胞作为试验对象,用浓度为50μg/ml的PM2.5水溶物和10μmol/L阳性对照Cr^6+染毒24 h即PM2.5组、Cr^6+组,同时设立空白对照组;荧光定量PCR检测癌基因(c-myc、c-fos、k-ras、p53)和凋亡基因[半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9]的mRNA相对表达水平;Western blotting检测癌基因和凋亡基因的蛋白质表达水平。结果与正常L02肝细胞比较,c-myc基因沉默细胞的c-myc基因表达明显受到抑制,其mRNA表达量下降81%。c-myc蛋白表达下降70%(P<0.01)。与正常L02肝细胞比较,PM2.5水溶物染毒组c-myc、c-fos、k-ras表达水平分别下降84.1%、45.4%、54.6%,p53表达升高192.9%、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达分别下降24.4%、36.1%、60.9%(P<0.05)。Cr^6+阳性对照组c-myc、c-fos、k-ras表达分别下降72.1%、82.2%、54.0%,p53表达升高250.0%,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达分别下降34.6%、36.0%、68.9%(P<0.05)。与正常L02肝细胞比较,PM2.5染毒组c-myc和c-fos蛋白表达量升高,p53蛋白表达量下降,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达升高(P<0.05);与c-myc基因沉默细胞比较,PM2.5染毒组c-myc和c-fos蛋白表达量下降,p53蛋白表达量上升(P<0.05)。结论PM2.5可引起L02肝细胞癌基因和凋亡基因表达水平明显升高,c-myc基因沉默在一定程度上能抑制PM2.5对凋亡基因和癌基因的激活作用。

摘要：目的:构建CYP1A2基因高表达载体,转染到L02肝细胞,建立CYP1A2高表达细胞株并检测三氯乙烯对该细胞株凋亡基因和癌基因的影响。方法:根据GenBank提供的CYP1A2基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒高表达载体pLVX-acGFP1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到CYP1A2高表达L02细胞株,通过荧光定量PCR和Westernblot对细胞株进行鉴定。用不同剂量三氯乙烯对正常L02肝细胞和CYP1A2高表达细胞进行染毒12h,采用PCR方法检测凋亡基因(Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)mRNA表达的变化。结果:测序证明重组慢病毒高表达载体CYP1A2基因序列与GenBank提供的CYP1A2序列一致,荧光定量PCR检测显示CYP1A2高表达细胞株CYP1A2mRNA表达比正常L02肝细胞提高317倍,Westernblot结果显示CYP1A2高表达细胞株CYP1A2蛋白表达水平比正常L02肝细胞高3.41倍。三氯乙烯染毒后,CYP1A2高表达细胞中凋亡基因Bcl-2mRNA表达水平与正常肝细胞无显著性差异(P>0.05),而Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9mRNA表达水平高于正常肝细胞(P<0.05或P<0.01)。CYP1A2高表达细胞中癌基因c-myc和p53mRNA表达水平低于正常肝细胞(P<0.05或P<0.01),而c-fos和K-rasmRNA则高于正常肝细胞(P<0.05或P<0.01)。结论:三氯乙烯对CYP1A2高表达细胞凋亡基因和癌基因表达有显著影响,提示CYP1A2是三氯乙烯在体内代谢的重要因素,与三氯乙烯毒性存在一定关系。

摘要：目的:构建类固醇合成急性调节蛋白(St AR)基因高表达载体,建立St AR基因高表达细胞,研究St AR基因高表达对邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(DEHP)毒性作用的影响。方法:根据Gen Bank提供的St AR基因c DNA序列设计引物,PCR扩增St AR基因并将其克隆到慢病毒载体中,构建St AR基因高表达MCF-7细胞,通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot鉴定细胞。用不同剂量DEHP染毒MCF-7细胞和St AR基因高表达MCF-7细胞24 h,检测细胞凋亡相关基因Bax、Caspase-3、Caspase-8在m RNA和蛋白表达水平的变化。结果:基因测序证明构建的St AR基因高表达载体序列正确,荧光定量PCR检测St AR基因转染细胞比正常MCF-7细胞St AR m RNA表达水平升高591.9倍(P<0.01),Western blot实验结果显示,St AR基因转染细胞比正常MCF-7细胞St AR蛋白表达水平升高190%(P<0.01)。不同剂量DEHP染毒St AR基因高表达细胞后,荧光定量PCR结果显示,St AR基因高表达细胞中Bax、Caspase-3和Caspase-8 m RNA表达水平较对照组(0 mmol/L DEHP)显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。Western blot实验显示,St AR基因高表达细胞中Bax、Caspase-3和Caspase-8蛋白表达水平比对照组显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:本实验成功构建了St AR基因高表达细胞,DEHP处理后St AR基因高表达细胞的凋亡相关基因表达水平较MCF-7细胞升高,提示St AR基因具有促进DEHP致细胞凋亡作用。

摘要：目的构建细胞色素氧化酶1A2(CYP1A2)基因沉默载体,转染L02人正常肝细胞(简称"L02细胞"),建立CYP1A2沉默细胞株并观察其对三氯乙烯(TCE)毒性的影响。方法 设计合成短发卡RNA(shRNA),连接到pLKO.1-puro质粒中构建CYP1A2 shRNA慢病毒表达载体,感染L02细胞。筛选CYP1A2沉默细胞株,采用荧光定量聚合酶链式反应和免疫印迹法鉴定。分别采用浓度为0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 mmol/L的TCE(设为相应的染毒剂量组)对L02细胞和CYP1A2沉默细胞染毒12 h,同时设置二甲基亚砜溶剂对照组(即0.00 mmol/L染毒剂量组),观察凋亡基因[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9]和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)等基因表达的变化。结果 测序证明插入pLKO.1-puro载体的CYP1A2基因干扰序列与设计的shRNA序列一致。CYP1A2沉默细胞的CYP1A2 mRNA和CYP1A2蛋白相对表达水平分别较L02细胞下降75.9%和82.4%(P<0.01)。TCE染毒后,0.25～4.00 mmol/L 4个染毒剂量组CYP1A2沉默细胞Bcl-2表达水平均高于相应染毒剂量组L02细胞(P<0.01);部分0.25～4.00 mmol/L染毒剂量组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和c-fos、c-myc、k-ras、p53相对表达水平均低于相应染毒剂量组的L02细胞(P<0.05或P<0.01)。结论 CYP1A2沉默降低TCE对L02细胞凋亡基因和癌基因的活化作用。

摘要：目的建立细胞色素氧化酶P450 2C9(CYP2C9)基因沉默正常肝细胞株(L02)并观察其对三氯乙烯(TCE)毒性的影响。方法设计合成短发卡RNA(shRNA)将其连接到PLVX-shRNA2P质粒中构建CYP2C9 shRNA慢病毒表达载体,感染L02细胞。采用荧光定量PCR和western blot筛选鉴定CYP2C9沉默细胞株。分别采用浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L的TCE染毒剂量组对L02细胞和CYP2C9基因沉默细胞株染毒24 h,同时设置二甲基亚砜溶剂对照组即0 mmol/L染毒剂量组,观察L02细胞和CYP2C9基因沉默细胞株细胞周期的变化以及凋亡基因Bcl-2和caspase-3表达变化。结果酶切和测序结果证明插入PLVX-shRNA2P载体的CYP2C9基因干扰序列与设计的shRNA序列一致。CYP2C9沉默细胞株的CYP2C9 m RNA和蛋白相对表达水平分别较shRNAc沉默对照细胞下降76.0%和78.6%。TCE染毒后,0.5、2.0、8.0 mmol/L 3个染毒剂量组CYP2C9基因沉默细胞和L02细胞周期没有发生显著变化。TCE染毒后,2.0和8.0 mmol/L染毒剂量组CYP2C9基因沉默细胞的Bcl-2表达水平均高于相应染毒剂量组L02细胞,而0.5、2.0、8.0 mmol/L 3个染毒剂量组CYP2C9基因沉默细胞的caspase-3表达水平没有显著变化。结论三氯乙烯对正常肝细胞和CYP2C9基因沉默细胞凋亡基因Bcl-2存在差异,提示CYP2C9与三氯乙烯在生物体内毒性存在一定关系。