摘要：目的评估结核分枝杆菌(MTB)重组特异性抗原ESXO在大肠埃希菌中的高效表达,并评价其免疫原性。方法采用常规分子克隆方法获得MTB重组蛋白ESXO。酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测84份确诊结核病(TB)患者血清和48份健康人血清中相应的抗结核ESXO抗体水平,评价血清学抗原活性,并与结核早期分泌蛋白ESAT-6和CFP-10的检测结果进行比较。结果重组特异性抗原ESXO在大肠杆菌中获得成功表达,其在*** BL 21 plysS(DE3)中以可溶性和包涵体两种形式存在,相对分子质量(27 300)与预期相符,血清学抗原活性评估结果显示其特异度和敏感度分别为94.0%(45/48)和32.1%(27/84),特异度与ESAT-6和CFP-10相当,敏感度高于ESAT-6。结论结核特异性抗原ESXO有望成为新的TB诊断与疫苗设计的候选抗原。

摘要：目的评估Xpert MTB/RIF、荧光PCR熔解曲线和基因芯片技术用于快速筛查利福平耐药结核病的临床价值。方法收集2016年9月3日至2019年8月11日在浙江省中西医结合医院收治的经Bactec MGIT 960液体培养药敏确诊为结核病,且具有Xpert MTB/RIF和基因芯片技术结果的150例患者临床资料,对所有患者分离培养菌株行荧光PCR熔解曲线检测。以Bactec MGIT 960液体培养药敏结果为金标准,分析Xpert MTB/RIF、荧光PCR熔解曲线和基因芯片技术对利福平耐药结核病的诊断效能。绘制受试者工作曲线(ROC)评估三种方法在利福平耐药结核病诊断中的价值。结果以Bactec MGIT 960药敏结果为金标准,Xpert MTB/RIF、荧光PCR熔解曲线和基因芯片技术检测利福平耐药的敏感度分别为88.89%(16/18)、94.44%(17/18)、88.89%(16/18),特异度分别为96.21%(127/132)、96.21%(127/132)、95.45%(126/132)。三种检测方法的敏感度和特异度比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。三种分子方法检测利福平耐药与Bactec MGIT 960药敏结果的一致性Kappa值分别为0.794、0.827、0.770。ROC曲线分析显示,Xpert MTB/RIF、荧光PCR熔解曲线和基因芯片技术的ROC曲线下面积分别为0.926、0.953、0.922。三种检测方法对利福平耐药均具有较好的诊断价值(P0.05)。三种方法检测利福平耐药与Bactec MGIT 960药敏不一致结果共8例。结论Xpert MTB/RIF、荧光PCR熔解曲线和基因芯片技术三种分子方法对利福平耐药性检测能力相当,均具有较高的敏感度和特异度,适合快速筛查利福平耐药结核病。

摘要：目的探讨应用多重PCR-单链构象多态性分析（multiplex—polymerase chain reaction—single strand conformation polymorphism，multi—PCR—SSCP）方法快速、特异地同时快速检测结核分枝杆菌对异烟肼和利福平耐药性的效能。方法根据结核分枝杆菌的inhA序列、katG序列、rpoB序列，分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物，采用multi—PCR—SSCP技术，一次性检出耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌。新方法的有效性通过116株临床分离株（70株耐异烟肼，66株耐利福平）的验证。结果Multi—PCR—SSCP方法检测临床分离株基因突变的有效性，以细菌培养和药敏试验结果为金标准。116株临床分离株和H37Rv标准株中除了4株katG缺失突变，其余菌株3个基因katG、inhA和rpoB在单基因PCR中都扩增成功。与H37Rv标准株相比，46株katG基因突变，14株inhA基因突变，58株rpoB基因突变。38株katG和rpoB，4株inhA和rpoB，4株inhA和katG同时突变，还有2株3个基因都有突变。multi—PCR—SSCP对于耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌检出的敏感度分别为80％、82％，特异度分别为100％和92％。结论multi—PCR—SSCP方法敏感、特异，能同时快速有效地检测耐多药结核分枝杆菌，有望成为临床指导用药的好方法，为深入研究耐药基因检测奠定了良好的基础。

摘要：目的建立可同步检测结核分枝杆菌katG和ropoB基因突变的等位基因特异性多重聚合酶链反应(MASPCR)的方法,以快速检测结核分枝杆菌对利福平(RFP)和异烟肼(INH)的耐药性。方法根据结核分枝杆菌katG和rpoB基因序列,分别设计特异性寡聚核苷酸引物,采用MASPCR技术,分别检测katG基因315位点和rpoB基因中531、526和516三个最常见的突变位点。结果19株INH敏感株中均未发现katG基因315位点的突变,耐药株中发现有79.2%(61/77)的菌株存在突变;15株RFP敏感株中未发现rpoB基因突变。MASPCR方法可检测出81.5%(66/81)的利福平耐药株。结论MASPCR方法对katG和rpoB基因的同步检测有较高的敏感性和特异性,有望用于耐药结核分枝杆菌的快速检测。

摘要：目的:评价基因芯片法和荧光定量PCR探针熔解曲线法直接检测结核病患者临床标本中结核分枝杆菌(MTB)耐药性的价值。方法:选取解放军总医院第八医学中心结核病医学部住院结核病患者临床标本44份(例),以传统药物敏感性试验(简称“药敏试验”)绝对浓度法为对照,应用基因芯片法直接检测临床标本中MTB对利福平、异烟肼的耐药性,以及采用荧光定量PCR探针熔解曲线法直接检测临床标本中MTB对利福平、异烟肼、左氧氟沙星的耐药性,评价这两种分子药敏试验方法的诊断效能。结果:以传统药敏试验绝对浓度法检测结果为标准,应用基因芯片法检测44份(例)临床标本,MTB对利福平和异烟肼耐药性的敏感度为87.5%(14/16)和85.7%(12/14),特异度为96.4%(27/28)和96.7%(29/30),准确度为93.2%(41/44)和93.2%(41/44),Kappa值为0.851和0.758。应用荧光定量PCR探针熔解曲线法检测44份(例)临床标本,MTB对利福平、异烟肼和左氧氟沙星耐药性的敏感度为87.5%(14/16)、85.7%(12/14)和85.0%(17/20),特异度为89.3%(25/28)、83.3%(25/30)和100.0%(24/24),准确度为88.6%(39/44)、84.1%(37/44)和93.2%(41/44),Kappa值为0.840、0.653和0.861。结论:基因芯片法和荧光定量PCR探针熔解曲线法直接检测临床标本中MTB对利福平、异烟肼、左氧氟沙星的耐药性与绝对浓度法均有较高的一致性,可作为临床制定化疗方案的参考依据。

摘要：我国是结核病高负担国家,同时结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)人数众多。高质量地开展LTBI流行病学调查,对于准确掌握我国LTBI的流行特征、评估不同人群的发病风险、开展高危人群的预防性治疗和探索适宜我国国情的结核病预防策略具有重要的指导意义。在本文中,笔者针对开展LTBI流行病学调查的必要性和LTBI流行病学调查的主要技术环节进行了总结和介绍,希望能够为我国系统性开展LTBI流行病学调查工作提供参考。

摘要：目的建立聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)检测结核分枝杆菌的方法并评价效果。方法针对结核分枝杆菌插入序列IS6110设计引物进行PSR检测。提取结核分枝杆菌基因组DNA,加入Bst DNA聚合酶的RM2X反应液中,在荧光定量PCR仪上于63℃反应45 min,通过荧光信号进行检测。通过对引物序列进行优化,筛选出最佳引物序列,并对其检测特异性和最低检出限进行评估。于2019年5—8月间从郑州市第六人民医院连续收集200例肺结核患者痰液样本(同一患者收集3份),对痰标本进行痰涂片、固体痰培养和PSR检测。以痰培养结果为参照,评价PSR对结核病患者的检测效能。结果通过引物序列优化,筛选出一套对结核分枝杆菌检测的PSR引物,使用该引物进行PSR的最低检出限可达到10~3菌落形成单位(CFU)/ml;检测特异性实验表明该方法与15株非结核分枝杆菌无交叉反应。200例肺结核患者中,痰涂片检测阳性48例,阳性检出率为24.0%(48/200);痰培养检测阳性83例,阳性检出率为41.5%(83/200);PSR方法检测阳性87例,阳性检出率为43.5%(87/200)。以痰培养结果为标准,PSR检测结核病的敏感度和特异度分别为96.4%(80/83)、94.0%(110/117),阳性预测值为92.0%(80/87),阴性预测值为97.3%(110/113),与痰培养检测方法基本一致(Kappa值为0.898)。结论PSR检测适用于结核分枝杆菌的快速筛查。

摘要：目的:建立一种快速检测结核分枝杆菌复合群(MTBC)和非结核分枝杆菌(NTM)的分子交叉引物恒温扩增技术(CPA)检测系统。方法:针对分枝杆菌高度保守的16S rRNA基因序列设计6套CPA引物和3个探针。以含16S rRNA基因序列质粒(浓度为1000拷贝/μl)为阳性模板,筛选确立最佳引物探针组合,并对建立的最佳反应体系进行敏感度、特异度和包容性分析。收集福建省龙岩市第二医院2022年2月8日至2023年3月14日具有肺结核症状或体征的125例疑似肺结核患者的标本,采用分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)和建立的CPA法对收集到的标本进行检测,并对两种方法间的检测结果一致性进行统计分析,采用Kappa值评估。Kappa值≥0.75,说明一致性好。结果:筛选出MTBC/NTM-16S-6引物和MTBC/NTM-16S-LR-FAM-3为分枝杆菌检测系统最佳引物探针组合,检测体系最低检测限为100拷贝/μl,检测时间为40 min,能检出MTBC和临床常见NTM,且与常见呼吸道细菌无交叉反应。与实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测方法相比,阳性预测值为95.65%(66/69),阴性预测值为85.71%(48/56),符合率为91.20%(114/125),Kappa值为0.82。结论:成功建立了一种基于CPA技术的快速检测MTBC和NTM的检测系统,能够为基层医院结核病疫情防控提供一种新的检测方法。

摘要：世界卫生组织(World Health Organization,WHO)之前关于表型药物敏感性试验(简称“药敏试验”)的应用及操作相关指南均针对改良罗氏培养基比例法药敏试验、液体药敏试验、Middle 7H10/7H11比例法药敏试验,从未就微孔板法药敏试验进行详细描述。考虑到利用肉汤微孔板法进行药物敏感性试验的优势,基于已有的研究基础和使用现状,WHO于2022年4月首次发布了《优化肉汤微孔板法结核分枝杆菌复合群药敏试验方法学》文件。笔者就该文件出台的背景、微孔板法药敏试验的优势、药物布局设计、方法学方面应考虑的事宜及对我国相关工作的启示等进行解读,以供我国相关科研、医疗人员及厂商参考。

摘要：目的:融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64ESAT6,为结核病的预防提供可供选择的有效亚单位疫苗.方法:设计含不同酶切位点的mpt64和esat6引物,采用PCR的方法从结核分枝杆菌毒株H37RvDNA中分别扩增出相应大小的DNA片段,将片段分别与Teasy载体连接测序.将测序正确的mpt64和esat6按照不同的酶切位点克隆入pProEXHT表达载体,挑选出阳性克隆,将诱导的表达产物进行SDSPAGE蛋白电泳分析,同时与6×His的mAb进行Westernblot分析,并用NiNTA亲合柱纯化表达产物.结果:PCR获得的mpt64和esat6序列与GenBank报道的完全一致.两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物Mr为38×103,与预计大小相吻合.Westernblot结果显示,在Mr约38×103处有表达产物与6×HismAb特异性结合带.表达产物为包涵体,通过NiNTA纯化系统,可得到纯化的目的蛋白.结论:结核分枝杆菌的分泌蛋白MPT64和ESAT6被成功的融合表达,有望为结核的临床判定提供有效的诊断试剂.