摘要：从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体(毕赤酵母表达型T载体),并通过表达重组纤维二糖水解酶II对该载体进行了检验。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片段的上游含XhoI和Eam1105I酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaI酶切位点。通过XhoI和XbaI位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105I酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因(cbh2)的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余氨基酸。

摘要：本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列 ;信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (hu mansolubleBLymphocyteStimulator,hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因 ;融合基因插入pcDNA3、pcDNA3 1、pEFneo质粒 ;信号肽引物设计时 ,突变同义密码 ,最终重组质粒成为分泌表达质粒 ;磷酸钙共沉淀将表达质粒和标志质粒pSV dhfr,共转染CHO—dhfr- 细胞 ;选择培养液筛选 ,氨甲喋呤扩增表达 ,获稳定表达rhsBLyS细胞株 ;ELISA检测浓缩表达上清 ,结果表明 :rhsBLyS表达量由 0 13 μg/mL上升至 0 5 5 μg/mL .

摘要：为获得高效表达外源蛋白的Pichiapastoris菌株而设计了重组质粒pPIC9K_vgbbxn ,其中透明颤菌血红蛋白基因vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度 ,腈水解酶基因bxn分泌表达。转化GS115菌株后 ,通过PCR、SDS_PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达 ,以及用准确的蛋白活性测定方法成功地检测到二者所表达的产物均具有正常的活性。摇瓶发酵实验证明 。

摘要：将提高菌体发酵密度的透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn共同克隆进巴斯德毕赤酵母的分泌型表达载体pPIC9K而设计了重组质粒pPIC9K-vgbbxn,其中vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度,bxn分泌表达。转化GS115菌株后,通过PCR、SDS-PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达,摇瓶发酵试验证明,血红蛋白在贫氧条件下可明显促进酵母菌体生长和bxn基因分泌表达。