摘要：目的评估Xpert MTB/RIF、荧光PCR熔解曲线和基因芯片技术用于快速筛查利福平耐药结核病的临床价值。方法收集2016年9月3日至2019年8月11日在浙江省中西医结合医院收治的经Bactec MGIT 960液体培养药敏确诊为结核病,且具有Xpert MTB/RIF和基因芯片技术结果的150例患者临床资料,对所有患者分离培养菌株行荧光PCR熔解曲线检测。以Bactec MGIT 960液体培养药敏结果为金标准,分析Xpert MTB/RIF、荧光PCR熔解曲线和基因芯片技术对利福平耐药结核病的诊断效能。绘制受试者工作曲线(ROC)评估三种方法在利福平耐药结核病诊断中的价值。结果以Bactec MGIT 960药敏结果为金标准,Xpert MTB/RIF、荧光PCR熔解曲线和基因芯片技术检测利福平耐药的敏感度分别为88.89%(16/18)、94.44%(17/18)、88.89%(16/18),特异度分别为96.21%(127/132)、96.21%(127/132)、95.45%(126/132)。三种检测方法的敏感度和特异度比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。三种分子方法检测利福平耐药与Bactec MGIT 960药敏结果的一致性Kappa值分别为0.794、0.827、0.770。ROC曲线分析显示,Xpert MTB/RIF、荧光PCR熔解曲线和基因芯片技术的ROC曲线下面积分别为0.926、0.953、0.922。三种检测方法对利福平耐药均具有较好的诊断价值(P0.05)。三种方法检测利福平耐药与Bactec MGIT 960药敏不一致结果共8例。结论Xpert MTB/RIF、荧光PCR熔解曲线和基因芯片技术三种分子方法对利福平耐药性检测能力相当,均具有较高的敏感度和特异度,适合快速筛查利福平耐药结核病。

摘要：【目的】建立利福平耐药基因rpoB高通量突变文库。【方法】通过同源重组和L5 attB噬菌体整合位点交换构建耻垢分枝杆菌ΔrpoB attB::rpoB菌株;基于L5 attB质粒交换系统和抗性选择培养基,挑取48个克隆以验证质粒替换的效率;针对利福平耐药决定区(RRDR)区域内以每3个碱基为单位设计简并性引物,通过PCR扩增获得该区域81个碱基的全覆盖式突变文库;文库片段与载体进行无缝克隆转化到大肠杆菌中形成大肠杆菌突变文库;基于质粒交换原理,将突变质粒库转化至耻垢分枝杆菌ΔrpoB attB::rpoB菌株中,替换原有L5 attB位点质粒,形成耻垢分枝杆菌突变文库;通过基因组提取、建库和高通量测序明确文库的基因型种类。【结果】与野生型rpoB基因(5600 bp)相比,敲除株的扩增片段为2200 bp,证明耻垢分枝杆菌ΔrpoB attB::rpoB条件性敲除株构建成功;质粒替换的成功率为100%;大肠杆菌文库和耻垢分枝杆菌文库中单氨基酸突变类型均为540种,大肠杆菌文库多点突变5301种,耻垢分枝杆菌文库多点突变853种,大肠杆菌文库和耻垢分枝杆菌文库相关系数为0.84。【结论】开发了一种针对分枝杆菌必需基因rpoB突变体文库的构建策略,成功建立了利福平耐药基因rpoB的突变文库。

摘要：目的:开发快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB寡核苷酸突变的基因芯片。方法:根据结核杆菌rpoB基因序列设计探针和引物并制备基因芯片,从临床痰标本中提取结核菌的基因组DNA,PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上的特异性寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果:22株临床痰标本有18株可用寡核苷酸芯片检测出来,正确率可达82%;患者痰液中少量DNA足够进行芯片检测,无须细菌培养。结论:利用寡核苷酸芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的准确性和敏感性,可以应用于临床耐药性诊断。

摘要：目的探讨临床患者痰标本中分离的结核分枝杆菌rpoB基因突变与利福平耐药之间的关系。方法对115株结核分枝杆菌应用L-J药敏培养法,检测对利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、氧氟沙星的耐药情况;根据rpoB基因序列设计包含利福平耐药决定区(RRDR)的扩增引物,PCR法进行扩增,运用生物信息学方法对耐药决定区扩增产物序列进行比对分析,对耐药株与非耐药株基因突变率进行统计学分析。结果 115株结核分枝杆菌经比例法药敏试验,RIF耐药株53株,占所有菌株的46.09%;53株RIF耐药株中39株rpoB基因存在不同位点的变异,突变率为73.58%,突变位点包括531、526、522、516、513、511,最主要的突变位点集中在531位,引起氨基酸呈Ser531Gln、Ser531Leu、Ser531Trp 3种形式改变;RIF敏感株62株,其中有2株检测到rpoB基因的突变,敏感株与耐药株突变率经McNemar统计检验,差异有统计学意义(P<0.05)。结论岳阳地区rpoB基因变异与利福平耐药呈高度相关,rpoB基因最主要的突变位点位于531位和526位。

摘要：耐药结核病的早期快速诊断是结核病控制中亟待解决的关键问题之一。利用基因型检测耐药性包括PCR产物直接测序法，错配PCR法等。错配PCR技术最早由Newton等于1989年建立并用于人抗胰岛素基因缺陷的检查，目前已广泛应用于基因点突变的检测。根据PCR引物设计的不同，可将其分为间接错配PCR，即引物与野生型完全互补，以突变株为模板不能扩增得到PCR产物，和直接错配PCR，即引物与特定的点突变完全互补，以野生株为模板不能扩增得到PCR产物。已有用间接错配PCR方法检测结核分枝杆菌利福平耐药的报道。本研究以检测耐利福平的结核分枝杆菌rpoB基因531位点的点突变为对象，建立了直接错配PCR法，并与间接错配PCR法进行了比较。