摘要：【目的】通过测定存活率及细胞内pH(pHi)变化,分析单核细胞增多性李斯特菌(单增李斯特菌)在体外模拟消化道中的抗性。【方法】模拟唾液、胃液和小肠液根据其主要组成成分配制,按试验设计顺次加入后获得模拟的消化道各段混合液(包括相应的pH及其可能的范围)。平板计数法测定单增李斯特菌在模拟消化液中的存活率,并用荧光比例成像显微镜(fluorescence ratio imaging microscopy,FRIM)测定细菌的pHi。【结果】单增李斯特菌在唾液中存活率>90%;经pH≤3.0的胃液处理后,其在胃液和胃-肠混合液中的存活率低于0.05%;提高胃液pH至3.5,细菌存活率开始上升;在胃液pH 4.0时,两株单增李斯特菌在模拟胃肠液中存活率显著提高(11.2%-85.9%)。FRIM研究表明,单增李斯特菌在模拟唾液中的pHi与对照组相近。经过pH为3.5和4.0的胃液和胃-肠混合液处理后,pHi值仍维持在较高水平(>7.75)。【结论】单增李斯特菌在经过pH≥3.5胃液后,能够维持菌体细胞内的pH稳态,且存活率较高,表明其细胞膜仍保持完整。

摘要：参考GenBank中单核细胞增多性李斯特菌(LM)第I毒力岛(LIPI-1)有关基因序列设计引物,分段扩增、克隆了分离菌株XFL0605LIPI-1毒力岛全基因序列,序列全长8 558 bp,包括完整的prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB6个基因。对LIPI-1编码的6个毒力基因进行序列分析,各毒力基因反映的进化关系不尽一致,表明李斯特菌株在获得外源性毒力基因方面具有不同步性,各毒力基因来源也不尽相同。应用相应软件对各毒力基因编码蛋白的信号肽、跨膜区进行预测,确定了基因序列中调控蛋白PrfA结合区核苷酸序列。分析并确认了hlyA基因及推导氨基酸序列PEST基序和C端保守11肽序列。研究还发现LM菌株XFL0605actA基因编码604个氨基酸,缺失了105 bp富脯氨酸重复片段编码碱基,只有2个E/DFPPPPXD/E重复序列。

摘要：以单增李斯特菌基因组DNA为模板,利用自行设计的引物,通过PCR法扩增出单增李斯特菌的iap基因。在iap基因的5'端和3'端分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ2个酶切位点将其克隆到pMD-18T载体上,构建克隆载体pMD-18T-iap。经测序正确后,将iap基因克隆至表达载体pET-28a上构建表达质粒pET-28a-iap。在IPTG诱导下,携带pET-28a-iap的***21(DE3)高效表达分子质量约为60kD的可溶性蛋白及包涵体形式的蛋白,其中可溶性蛋白占总p60蛋白含量的76.3%左右。诱导表达的可溶性蛋白通过Ni2+亲和层析柱纯化得到纯度在95.6%以上的重组p60蛋白,其提取率为68.3%左右。

摘要：根据GenBank登陆的单增李斯特菌标准株EGD序列设计引物,PCR扩增LM01847基因片段后插入表达载体pET-30 a,构建重组原核表达载体,并在E. coliBL21中成功表达。纯化目的蛋白制备多抗,ELISA结果显示:该蛋白多抗与单增李斯特菌全菌、全菌多抗与该蛋白均可发生反应。证明该蛋白在天然状态下存在于单增李斯特菌表面,且具有良好的免疫反应性。该蛋白在45℃、高盐、酸性环境中表达水平基本稳定,但在低pH值条件下反应活性消失;高盐或低温条件下,表达量随盐浓度的升高或温度的下降而降低。除4℃以外,该蛋白均能保持良好的免疫反应活性。本研究为建立针对该蛋白的李斯特菌免疫微球凝集、免疫磁珠分离等检测方法奠定基础。

摘要：目的　探索建立快速、敏感、特异的单核细胞增多性李斯特菌的PCR检验方法。方法　以单核细胞增多性李斯特菌hly A基因作为靶序列设计一对引物,并以单核细胞增多性李斯特菌标准菌株中提取的DNA作为模板,用常规PCR和荧光定量PCR对单核细胞增多性李斯特菌进行鉴定。结果　含有一段特异基因的6 0 0 bp片段,表现出良好的单核细胞增多性李斯特菌种特异性。结论　荧光定量PCR比普通PCR特异性强、灵敏度高、重现性好,可以定量、快捷地应用于检测单核细胞增多性李斯特菌。

摘要：根据多条单核细胞增多性李斯特菌的hly基因序列,设计了1对简并引物和1条TaqMan探针,建立荧光定量PCR快速检测单核细胞增多性李斯特菌的方法,对该方法的特异性、灵敏度进行了验证,并采用该法对染菌的鲜切甜瓜进行了检测。结果表明,该方法具有较好的特异性,对质粒标准品的灵敏度为1.12×102copies/μL,对染菌的鲜切甜瓜中单核细胞增多性李斯特菌的最低检出限为6.28×102cfu/mL。该方法可为快速检测鲜切果蔬病原微生物污染度及其控制奠定技术基础。

摘要：为应用PCR快速检测食品中的单核细胞增多性李斯特菌,设计合成了针对单核细胞增多性李斯特菌溶血素编码基因的特异性引物进行PCR扩增。结果表明,在单核细胞增多性李斯特菌中能扩增出348bp的预期片段,大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和李斯特属的绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌和格氏李斯特菌的扩增结果均为阴性。用该方法检测了81份食品样品,检测结果与分离鉴定方法一致,表明本方法可用于食品中单核细胞增多性李斯特菌的快速检测。检测样品中,单核细胞增多性李斯特菌污染率为8.6%,以禽肉类制品中的污染率最高。

摘要：目的　探索一种快速、敏感、特异的单核细胞增多性李斯特菌检验方法。方法　以单核细胞增多性李斯特菌hly A基因作为靶序列设计一对引物,并以标准单核细胞增多性李斯特菌菌株中提取的DNA作为模板,用常规PCR和荧光定量PCR对单核细胞增多性李斯特菌进行监测与鉴定。结果　含有一段特征基因的6 0 0 bp片段,具有良好的单核细胞增多性李斯特菌检测特异性。结论　荧光定量PCR比普通PCR具有特异性强、灵敏度高、重现性好。可以定量、快捷的应用于监测检验单核细胞增多性李斯特菌。

摘要：根据单核细胞增多性李斯特菌ActA基因序列保守区设计一对引物，对21个菌株进行PCR扩增，得到长度为820bp的片段。PCR产物经过纯化后直接测序，并对其中的506bp进行同源性分析。结果表明单核细胞增多性李斯特菌分离株具有5个明显不同的克隆谱系，每个谱系的同源性均在95％～100％。16个单核细胞增多性李斯特菌奶相关和环境分离株可被分成4个谱系，其中2个谱系（C、D）均为奶相关分离株和成品奶分离株；加工厂地面污水分离株为独立的一个谱系。初步表明，成品奶中污染的单核细胞增多性李斯特菌来自于奶牛场，而非加工环境。

摘要：目的建立一种快速、简便、准确,适合于基层应用的检测鉴定Lm的方法。方法选取iap基因作为靶序列设计一对引物,用该引物对4株标准株及4株无关菌进行PCR扩增,得到进一步验证。采用PCR和常规方法同时对人工感染的牛奶进行检测鉴定。结果4株标准株获得了预期700bp左右的扩增片段,而同属的***、***、粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌均没有这一特异性条带。检测人工感染牛奶20份,检出率为90%,高于传统分离培养法(60%)。结论建立的PCR法可用于单增李斯特氏菌的快速、特异、敏感诊断。