摘要：由黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala Sydow)引起的甘蔗褐锈病是甘蔗生产中较为严重的叶部病害之一。建立该病原菌的高效检测与特异性鉴定技术体系,对于该病害的监测、预警以及及时采取必要的防治措施均具有重要的意义。为此,本文基于甘蔗褐锈病菌ITS序列保守区域位点设计了该病原菌的单管巢式pcr引物对,对外内引物退火温度、外内引物浓度比两个方面进行筛选与优化,并对所建立的单管巢式pcr检测体系的特异性和灵敏度进行了分析。结果表明,所设计的甘蔗褐锈病菌单管巢式pcr外引物PmF1/R1、内引物PmF2/R2的退火温度分别为63℃与52℃,以及外引物PmF1/R1与内引物PmF2/R2最佳终浓度比例为0.5 pmol/L∶0.5μmol/L时,单管巢氏pcr检测体系较佳。所建立的甘蔗褐锈病菌单管巢式pcr检测体系仅从含有甘蔗褐锈病菌DNA模板中检测出预期大小的特异性条带,而从含甘蔗黄锈病菌、咖啡驼孢锈菌、鸡蛋花鞘锈菌、葡萄层锈病菌、甘蔗黑穗病菌、橡胶炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、稻瘟病菌、剑麻茎腐病菌的DNA中并未扩增出任何条带。通过模板梯度稀释法证实,所建立的单管巢氏pcr检测体系的最低检测限为10 fg/μL,是普通pcr灵敏度的1000倍。田间19份疑似病样单管巢式pcr检测结果,有18份样品DNA中含有甘蔗褐锈病菌。本检测方法可以用于甘蔗褐锈病病原菌的快速诊断及其病害监测,为该病害预测、预报提供技术支持。

摘要：猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原体。为建立一种灵敏度更高且特异性更强的分子检测技术,研究建立一种猪圆环病毒2型单管巢式pcr检测技术。首先利用梯度pcr方法验证内外引物的最佳退火温度;再利用正交试验设计的方法对单管巢式pcr反应体系的内外引物浓度、Ex Taq酶用量等相关因素进行优化。结果表明,当外引物PCV2-P1/P3退火温度为64.4℃,内引物PCV2-1/2退火温度为54.4℃,通过正交试验最终筛选出的最佳反应体系(25μL)为:2×Taq pcr Mastermix 10μL,100μmol/L的内引物PCV2-1/2各1μL,10μmol/L的外引物PCV2-P1/P3各0.2μL,模板DNA 2.5μL,ddH_(2)O 10.1μL。上述反应体系仅对猪圆环病毒2型扩增出特异性目的条带,具有高度特异性,最低检测下限针对猪圆环病毒2型DBN-SX07株目的基因的最低DNA模板量为0.6×10^(-6) ng、ZJ/c株目的基因的最低DNA模板量为0.6×10^(-3) ng。研究建立的猪圆环病毒2型单管巢式pcr检测方法可以有效针对猪圆环病毒2型特异性检测。

摘要：由专性寄生菌咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)引起的咖啡叶锈病是小粒种咖啡生产中的一种毁灭性病害,建立高效、准确的分子检测技术对于该病害的快速鉴定与监测具有重要意义。本研究基于咖啡叶锈病菌ITS序列保守区域设计该病原菌的单管巢式引物对,通过单因素试验筛选外引物与内引物退火温度后,进一步对单管巢式pcr检测反应体系的内、外引物浓度、dNTPs浓度、以及rTaq酶用量等4个关键因素进行正交优化试验,从而建立高效的单管巢式pcr检测反应体系。结果表明,咖啡叶锈病菌单管巢式pcr外引物HvF1/HvR1、内引物HvF2/HvR2的最佳退火温度分别为63℃与52℃。正交试验显示,在20μL的反应体系中各组分的最佳含量分别为:10×rTaq Buffer 2.5μL,2.5 mmol/L dNTPs 3.2μL,rTaq DNA Polymerase(5 U/μL)1.8μL,7μmol/L的HvF2/HvR2各1μL,1nmol/L的HvF1/HvR1各1μL,模板DNA1μL,ddH207.5μL。所建立的单管巢式pcr检测体系具有高度特异性,能从含有咖啡叶锈病菌DNA模板中检测出特异性条带,而其他供试的非咖啡叶锈病菌DNA模板中扩增不出任何条带。该检测技术体系的最低检测限为5 fg/μL,是普通pcr灵敏度的100倍。采集的22份早期疑似病样经检测鉴定均含有咖啡驼孢锈菌。本试验建立的单管巢式检测技术可用于咖啡叶锈病菌的快速鉴定,可用于病害监测预警。

摘要：根据GenBank上发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列(登录号U88565)设计合成2对引物,建立了猪附红细胞体单管巢式pcr诊断方法,经酶切分析、单管巢式pcr进一步鉴定后进行序列测定,并与血涂片染色镜检、常规pcr进行了比较。结果:扩增的猪附红细胞体基因序列与GenBank中发表的猪附红细胞体基因序列(U88565)同源性为96%;特异性试验表明,设计的引物不能扩增弓形虫、链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌及羊附红细胞体等病原体;敏感性试验表明,单管巢式pcr诊断方法最低能够检测出0.116 fg的标准模板DNA。通过对75份血液样本的检测表明,建立的单管巢式pcr方法明显优于血涂片染色镜检法及常规pcr方法,具有较高的敏感性和实用性。本试验建立的单管巢式pcr诊断方法具有特异、敏感、实用等优点,为猪附红细胞体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术。

摘要：设计了针对转基因Roundup Ready大豆外源基因扩增的内外2对引物,分别位于CaMV35s启动子,CTP基因,CP4EPSPS基因区域,并成功对精炼大豆油中的外源基因进行单管巢式pcr检测。结果表明,用改良试剂盒法和冷冻干燥法提取大豆油中的DNA均可以满足单管巢式pcr检测要求;单管巢式pcr扩增对内外引物的Tm值有特殊要求,外引物的退火温度高于内引物。本实验建立的精炼大豆油转基因成分的单管巢式pcr检测方法特异性强,灵敏度高且快速方便。

摘要：采用正交设计的方法对大豆油转基因成分单管巢式pcr检测反应体系的5因素(内引物浓度、外引物浓度、DNA模板用量、Taq酶用量和Mg2+浓度)在4水平上进行优化试验,优化结果采用电泳图进行直观分析,在反应体系得到优化的基础上分别对内外引物的Tm值进行梯度pcr,筛选最佳退火温度。结果表明,单管巢式pcr中内外引物的浓度差对反应结果影响最大,内引物与外引物的比例为60倍时反应条带最清晰且无非特异性条带,单管巢式pcr扩增对内外引物的Tm值有特殊要求,外引物的退火温度高于内引物。试验采用正交试验优化的单管巢式pcr反应体系特异性强,灵敏度高且快速方便。