摘要：为了研究胞质视黄酸结合蛋白2(cytoplasm retinoic acid binding proteins 2,Crabp2)对猪卵泡发育的调控作用及机制,笔者通过构建猪Crabp2过表达载体并设计Crabp2 siRNA干扰片段,揭示它们对猪卵泡颗粒细胞凋亡的影响。通过从屠宰场回收猪卵巢,应用TRIzol法提取组织总RNA,并反转录成cDNA。设计Crabp2基因全长引物,利用PCR克隆Crabp2基因,构建Crabp2过表达载体。同时,设计并筛选出干扰效率最高的Crabp2 siRNA。将Crabp2过表达载体和siRNA片段分别转染至猪卵泡颗粒细胞中24 h,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western-blot)检测颗粒细胞Crabp2的表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化,同时检测线粒体凋亡通路和死亡受体凋亡通路相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3、Fas及FasL的表达变化。对照组为转染pcDNA 3.1(+)空载体和siRNA阴性对照(NC)片段的卵泡颗粒细胞。结果显示,Crabp2过表达载体转染猪卵泡颗粒细胞可使细胞Crabp2的表达极显著升高(P<0.01),同时显著降低细胞凋亡率(P<0.05),而细胞凋亡通路中抑凋亡基因Bcl-2的表达显著升高(P<0.05),促凋亡基因Bax、Caspase-3、Fas极显著降低(P<0.01),FasL显著降低(P<0.05)。与此相反,Crabp2 siRNA片段转染猪卵泡颗粒细胞可使细胞Crabp2的表达极显著降低(P<0.01),同时显著增加细胞凋亡率(P<0.05),而Bcl-2的表达显著降低(P<0.05),Bax、Caspase-3和FasL极显著升高(P<0.01),Fas显著升高(P<0.05)。结果表明,Crabp2可能通过抑制Fas/FasL介导的死亡受体凋亡通路和线粒体凋亡通路,进而抑制猪卵泡颗粒细胞凋亡,从而参与调控猪卵泡的发育。

摘要：　采集绵羊卵泡颗粒细胞进行体外培养,根据试验设计加入褪黑素(MLT)和HCG,分别于不同培养时间收集细胞培养液,用放射免疫测定法(RIA)测定细胞培养液中雌二醇(17β-E2)和孕酮(P4)含量。结果表明:卵泡颗粒细胞在无血清培养体系中可体外培养,并能够分泌相应17β-E2;用MLT或MLT与HCG共同处理卵泡颗粒细胞,能促进细胞分泌17β-E2,并呈时间和剂量的依赖性,但对P4的分泌没有影响。

摘要：目的:目前为止,尚不清楚micro-RNA(miR)-let-7b是否通过MAP3K1调节卵泡颗粒细胞(FGCs)凋亡,本研究拟运用PCR和Western blotting方法对此进行实验验证.方法:应用CCK-8测定细胞存活率.设计合成miR-let-7b和MAP3K1 mRNA特异性引物,利用qRT-PCR和Western Blotting分析FGCs中miR-let-7b和MAP3K1 mRNA基因与蛋白的表达水平.结果:随着miR-let-7b模拟物剂量(40、60、80、100、120μM)的增加,FGC的增殖活性逐渐降低,MIM-4组的增殖活性明显低于CG和MIM-1组(P<0.05).miR-let-7b表达水平随着模拟物剂量的增加而逐渐降低,MIM-3和MIM-4组的miR-let-7b水平低于MIM-1(P<0.05或P<0.01).MIM-3和MIM-4组MAP3K1 mRNA和蛋白水平显著低于CG,而且MIM-4组MAP3K1 mRNA和蛋白水平低于MIM-1组(P<0.05).结论:miR-let-7b可明显降低FGC增殖活性.下调FGC中miR-let-7b mRNA表达水平,miR-let-7b处理可剂量依赖性地降低MAP3K1 mRNA和蛋白质表达水平.