摘要：目的构建pEGFP—N1—TGF-β1重组质粒，利用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC-Ⅱ）中，为构建实验性干预急性肺损伤的真核表达载体及转染原代培养AEC-Ⅱ提供方法学基础。方法应用含人TGF—β1CDS的质粒，设计PCR引物扩增出其CDS片段，将其与空质粒pEGFP—N1用Xhol和EcoRI双酶切，T4DNA Ligase连接双酶切产物，将连接产物转化入DH5α中，培养16h后抽提质粒，PCR法鉴定和测序证实TGF—β1 CDS序列正确。采用Lipofectamine 2000脂质体介导转染，将新生猪AEC—Ⅱ原代培养48h至细胞融合80％-90％，换为无血清培养液；将质粒DNA（pEGFP—N1-TGF—β1重组质粒）和Lipofectamine 2000加至DMEM培养液中混匀，置于培养箱中培养4—6h，更换为完全培养液；转染24—48h后，荧光显微镜下观察细胞EGFP表达水平。结果PCR法及测序鉴定证实TGF—β1 CDS序列正确，重组质粒构建成功，采用Nanovue超微量分光光度计测浓度质粒浓度为195．5μg/mL，转染后48h在荧光显微镜下可见细胞有绿色荧光表达，证实已将其成功转染入原代培养的AEC—Ⅱ中。结论成功构建了pEGFP-N1—TGF-β1真核表达载体，并首次采用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪AEC—Ⅱ中，为开展其他实验性干预ALI的基因转染并进一步研究其修复作用及转归提供方法学基础。

摘要：目的:体外分离培养人脐静脉内皮及内皮下间充质干细胞,观察采用不同的换液频度与细胞增殖和生长的关系。方法:实验于2006-03/11在辽宁医学院解剖学实验室完成。①选取正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带,由辽宁医学院附属第一医院提供,产妇及其家属均知情同意。②根据更换细胞培养液时间的不同,分为接种后每24h,48h,72h更换培养液组。③无菌条件下将脐带用预热的磷酸盐缓冲液充分洗涤去血渍,从脐静脉一端插入留置针,用预热的磷酸盐缓冲液冲净静脉腔血,止血钳夹闭另一端,采用胶原酶消化法分离人脐静脉内皮及内皮下细胞,取消化30min的细胞悬液进行贴壁培养,以1×108L-1密度接种于24孔培养板中,每孔的细胞数和培养液量相同,按实验设计分组的时间方法更换培养液。④各组自培养24h开始,每天分别取各组细胞4孔,以噻唑蓝比色法测定生长曲线。并采用免疫细胞化学方法对分离的细胞进行表面抗原鉴定。结果:①间充质干细胞的形态学观察:原代培养1周,细胞以梭形细胞为主。传代培养2h细胞开始贴壁变形,24h基本完成贴壁,48h可见部分已贴壁的细胞开始分裂增殖,细胞形态多样,呈椭圆形、梭形、三角形等。5～7d贴壁细胞可见多核的成纤维细胞样。在细胞生长增生过程中,接种后每24h更换培养液组细胞增殖明显,生长状态均最好;接种后每48h更换培养液组次之;接种后每72h更换培养液组细胞增殖较慢,细胞生长状态也较差。②生长曲线:接种后每24h更换培养液组的细胞生长增殖较快,比接种后每48h及72h更换培养液组达到的同样细胞数平均提前2～3d(P0.05)。③间充质干细胞表面抗原特性:免疫细胞化学分析显示CD166呈阳性,vWF呈阴性。结论:胶原酶消化法体外分离获得的人脐静脉内皮及内皮下细胞数量高、活性佳。更换培养液的频度不同,细胞的增殖生长过程和形态变化时间不同,接种后每24h更换培养液更有利于间充质干细胞的增殖生长和纯化。

摘要：本试验旨在评估十二指肠上皮细胞不同接种密度对细胞紧密连接性及细胞活力的影响,为建立肉鸡鸡胚体外原代培养十二指肠上皮细胞吸收模型选择最佳的细胞接种密度。试验采用单因子完全随机试验设计,共设3个组,Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞接种密度分别为2.90×10~6、6.25×10~6、8.75×10~6个/m L,每个组6个重复,共培养4 d。结果表明:1)刚分离的十二指肠上皮细胞团呈球形,且细胞团的大小均一,悬浮于培养液中,贴壁后细胞团开始向外伸展,逐渐铺成片,细胞之间界限清晰、贴壁均匀,呈单层"铺路石样"生长。2)经碱性磷酸酶染色,阳性试验组的十二指肠上皮细胞胞浆被染成了蓝黑色,阴性对照组的十二指肠上皮细胞不着色。3)在细胞培养的48和72 h,Ⅰ组和Ⅱ组细胞的跨膜电阻(TEER)值均满足大于300Ω·cm2的试验要求,酚红透过率均满足小于5%的试验要求,并且Ⅰ组细胞的TEER值显著高于Ⅱ组(P0.05)。4)在细胞培养的24和48 h,Ⅰ组细胞培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)活力均显著低于Ⅱ组和Ⅲ组(P<0.05)。以上结果表明,细胞接种密度为2.90×10~6个/m L,培养时间为48 h时,细胞间界限清晰、生长状态良好、紧密连接性强,细胞活力最佳,说明原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞物质吸收模型构建成功,可为后续十二指肠上皮细胞的吸收规律及其分子机制的研究提供了良好的试验模型。

摘要：为解决传统实验教学中学生实验成功率低、能力素质锻炼不足的问题,对面向本科生的动物细胞原代培养实验教学进行改革,构建一种巩固递进式实验教学模式并付诸实践。该实验教学模式对重要且应用广泛的无菌技术、酶消法细胞原代培养技术进行多次巩固练习,并随实验项目的依次开展,逐步引入植块法细胞原代培养、免疫细胞化学鉴定对细胞原代培养实验进行递进深化,还适时安排学生进行先易后难的自主实验方案设计,实验的扩展性、深入性、综合性和设计性等均相应递增。学生的实验结果和教学效果问卷调查结果显示,该巩固递进式实验教学模式提高了学生的实验成功率,强化了学生实践、合作、分析和解决问题的能力,提高了实验教学质量。

摘要：目的体外分离、培养并鉴定成年小鼠背部皮肤角质形成细胞(KC);对比4种品系小鼠KC的增殖与分化能力。方法剪取4种品系成年小鼠背部皮肤,剥离皮下脂肪组织,0.25%胰蛋白酶消化获得KC;免疫荧光法鉴定KC;显微镜下观察细胞生长状况;设计不同的种板时间和密度,使用CCK-8法、EdU和高内涵法检测细胞增殖活力;通过Western blot检测4种成年小鼠KC分化情况。结果对4种品系成年小鼠背部相同面积的皮肤组织进行胰蛋白酶消化,昆明(Kunming,KM)小鼠提取的KC数量最低,C57BL/6提取的细胞数量最多;BALB/c、KM、裸小鼠分别以8×10^(3)个/孔的密度铺板增殖效率较高,C57BL/6以1.6×10^(4)个/孔的密度铺板增殖效率较高;4种品系小鼠,BALB/c小鼠原代KC较C57BL/6小鼠原代KC增殖能力弱,分化程度差异无统计学意义。结论采用简便易行的方法成功分离并比较4种成年小鼠背部皮肤原代KC的增殖和分化能力,为皮肤相关疾病模型小鼠的品系选择提供一定实验依据。

摘要：以栉孔扇贝(chlamysfarreri)外套膜为材料,采用几种除菌方法进行除菌处理后,应用自己设计的培养基对其进行了原代培养。实验结果表明,以青霉素、链霉素和复方洗必泰混合溶液除菌,对组织损伤小,除菌彻底。在此培养条件下,栉孔扇贝外套膜细胞能正常迁出和生长。

摘要：为了评估无机纳米材料的疗效，设计了一种体外实验方法－等密度Ｐｅｒｃｏｌｌ离心法。该法是在Ｓｅｇｌｅｎ法分离肝细胞基础上改良的。实验表明，分离所得肝细胞形态、起微结构正常，具有较高的存活率和纶度。结果表明，这是一种有效、安全和可行的方法，便于操作，且不需要特殊的仪器设备。

摘要：肠上皮细胞是由多功能干细胞分化成的一个高度组织化系统。从离体的肠组织中分离的肠隐窝单位或肠上皮细胞可在数小时内保持高度活力,但要长期(达到10 d)原代培养肠上皮细胞仍然很困难。文章对肠上皮细胞的分离、鉴定、原代培养所需维持培养基和生长培养基的设计及培养条件等方面进行了综述。

摘要：目的设计原代培养SD大鼠星形胶质细胞。方法 取新生第2～3d SD红皮鼠,无菌操作下取大脑皮质,剪碎、胰酶消化结合机械吹打使细胞分散,网筛过滤,差速粘附处理去除成纤维细胞,将未粘附的细胞悬液接种培养9～12d,置摇床,舍弃含脱落细胞的细胞悬液,以去除少突胶质细胞和小胶质细胞。细胞传代,GFAP免疫组化染色鉴定。结果 成功分离培养了原代神经胶质细胞,并进行了星形胶质细胞的纯化,GFAP鉴定星形胶质细胞比例为95％以上。结论 建立星形胶质细胞体外培养方法,总结操作关键,以此为实验材料对于比较学研究是非常有帮助的。

摘要：目的建立树鼩角膜内皮细胞(corneal endothelial cells,CECs)体外分离、培养及纯化的稳定技术,为人类眼科角膜疾病提供新的实验材料。方法通过比较揭膜法、双酶消化法及揭膜-消化两步法,确定每种树鼩原代CECs取材方法的优劣性。分别使用DMEM/F12,M199,Ham’s F12/M199三种培养液以确定树鼩CECs原代细胞最适培养液。使用TGF-β抑制剂、低血清培养法及梯度消化法来探讨树鼩CECs纯化的可行性。苏木精-伊红染色观察细胞形态,根据树鼩神经元烯醇化酶(NES)设计并筛选特异性引物,使用PCR方法检测细胞NES表达情况并用NES抗体进行细胞免疫荧光染色鉴定。结果揭膜法可以快速、有效得到高纯度的树鼩CECs细胞。Ham’s F12/M199培养液是树鼩CECs的最适培养液。使用TGF-β抑制剂可以达到CECs的纯化目的。结论优化的树鼩CECs细胞培养纯化方法对树鼩CECs的体外培养更适宜,优化条件下分离培养的细胞符合CECs的一般特征。