摘要：研究旨在对前期测序筛选到的关键LncPGCT8对鸡原始生殖细胞(PGCs)形成的影响进行深入探究。试验通过qRT-PCR和组织表达谱分析LncPGCT8在鸡PGCs和生殖嵴中的表达量。在体内外过表达/干扰LncPGCT8,通过qRT-PCR、流式细胞术、间接免疫荧光和免疫组织化学染色检测体内外PGC形成效率。结果显示:LncPGCT8在鸡PGCs和性腺中均显著高表达(P<0.05),过表达LncPGCT8组PGCs形成效率显著高于对照组(P<0.05),干扰LncPGCT8则会显著降低PGCs形成数量(P<0.05)。结果表明LncPGCT8在体内/外均促进鸡PGCs形成,为提高体外诱导PGCs效率奠定理论基础。

摘要：目的:构建小鼠原始生殖细胞(PGCs)报告基因系统。方法:根据CRISPR基因编辑技术结合同源重组原理,针对鼠Prdm1和Dppa3基因的翻译起始位点ATG附近位置分别设计一对sgRNA,并根据Cas9切割位点以及拟插入目的片段构建相应的用于同源重组的供体质粒,将sgRNA与Donor质粒同时转染入小鼠胚胎干细胞(ESCs)中,并利用质粒携带的抗性基因筛选出目标单克隆细胞,并进行基因型鉴定。结果:通过提取单克隆细胞的基因组DNA进行基因型鉴定,PCR和Sanger测序结果显示,单克隆细胞的基因组中,Prdm1和Dppa3基因翻译起始位点后分别成功插入eGFP和mCherry荧光蛋白编码序列。利用细胞因子诱导eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3mESCs(mouse ESCs)定向分化为mPGCs(mouse PGCs),流式细胞仪检测显示诱导分化的mPGCs特异表达eGFP和mCherry荧光信号。结论:成功构建mPGCs报告基因系统,可用于后续研究mPGCs命运决定的分子机制,对于研究小鼠早期胚胎发育过程具有重要意义。

摘要：背景:目前在胚胎多潜能干细胞建系和培养过程中,存在着建系率低、具有正常核型的干细胞系比率低等问题。目的:观察接种于人子宫内膜成纤维细胞饲养层上原代培养的人原始生殖细胞在体内外的生物学特性。设计、时间及地点:细胞观察,于2004-01/2005-04在沈阳市妇婴医院和中国医科大学完成。材料:人胚胎来源于流产孕妇,用于分离培养原始生殖细胞。人子宫内膜来源于因子宫肌瘤行子宫切除术的患者,用于制备成纤维细胞饲养层。清洁级10周龄雄性裸鼠2只,用于体内分化实验。方法:从人胚胎生殖嵴、肠系膜中消化分离的原始生殖细胞,将其接种在人子宫内膜成纤维细胞饲养层上传代培养。体内实验取连续传5代的2个细胞株,分别制备浓度为1×109L-1的细胞悬液,于每只小鼠两侧腹股沟处皮下各接种0.5mL,培养8周。体外分化采用无黏附特性的培养瓶和除去白血病抑制因子的原始生殖细胞培养液,以脱饲养层法悬浮培养扩增的细胞,直到拟胚体形成及贴壁分化。主要观察指标:通过免疫荧光检测胚胎干细胞特异性表面标志物的表达、碱性磷酸酶染色及染色体核型分析,对所培养细胞进行鉴定。检测裸鼠体内畸胎瘤的形成及组织分化。免疫组化染色观察体外肌肉特异性肌动蛋白、巢蛋白、广谱细胞角蛋白的表达。结果:①传至第2、7代的人胚胎原始生殖细胞SSEA-4,SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81等表面标志物均呈阳性表达,碱性磷酸酶染色呈阳性,染色体分析为正常二倍体核型46XX。②接种8周末,2只小鼠均形成皮下畸胎瘤,其内存在囊括3个胚层的组织结构,包括皮脂腺、脂肪、腺体及腺上皮、鳞状上皮等。③培养第4天形成拟胚体,肌肉特异性肌动蛋白、巢蛋白、广谱细胞角蛋白均呈阳性表达。结论:人子宫内膜成纤维细胞可以作为人原始生殖细胞的饲养层细胞,传代后的原始生殖细胞仍保持胚胎干细胞的未分化状态和发育全能性。

摘要：背景：利用原始生殖细胞技术可以方便地将各种外源基因转入鸡体内,以较快的速度获得转基因鸡,但到目前为止原始生殖细胞的转染效率仍然很低,且很难进行较大基因片段的转染。目的：拟实现大分子BAC载体对鸡胚原始生殖细胞的转染。设计、时间及地点：基因水平的细胞学体外观察,于2006-08/2008-07在广东省佛山大学完成。材料：种蛋来自华南农业大学鸡场粤黄鸡群,受精蛋在37.5℃、相对湿度为65%的条件下孵化68~72h。BAC-TDN-GID载体由佛山大学分子生物学实验室保存。方法：以rRNA基因及其间隔序列作为同源重组引导序列,构建含GFP基因和hIFN基因的大分子BAC基因打靶载体,将鉴定为阳性的载体进行扩增培养并大量抽提。取课题组孵化至第19期的粤黄鸡胚,挑取其生殖嵴或性腺,胰酶消化法获得原始生殖细胞,并辅以饲养层和生长因子进行培养。采用脂质体介导法在原始生殖细胞内进行基因转移,对存活的细胞进行目的基因DNA水平和RNA水平鉴定。结果：第19期鸡胚性腺原始生殖细胞体外培养48h呈桑椹状或者椭圆状,72h形成细胞集落,过碘酸染色呈紫红色。分子量达30kb的大分子转基因载体BAC-TDN-GID转染鸡胚原始生殖细胞48h可见荧光细胞,表明转染成功。经PCR和RT-PCR鉴定,证实扩增的产物大小与预期结果大致相吻合,目的基因hIFN已经整合进入原始生殖细胞基因组,并已开始表达。结论：实验成功将大分子BAC载体上的外源基因转染入体外分离培养的鸡胚原始生殖细胞。

摘要：目的研究邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate,DBP)诱导雄性生殖功能异常的传代效应。方法对4~5月龄的成年雄性斑马鱼进行连续30 d的DBP的暴露实验,分别设置空白对照组,溶剂(丙酮0.01%)对照组,0.2、0.6和1.8 mg/L DBP暴露组;暴露后的雄性斑马鱼定义为F0代。各组随机选择20条F0代雄鱼与野生型雌性斑马鱼交配产卵(称F1代测交胚胎)进行实验。F1代受精后6、24、48和72 h(hour post fertilization,hpf),用显微镜观察F1代测交胚胎发育形态改变,测定24hpf自主运动次数和72hpf心率。采用胚胎整体原位杂交技术标记原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)迁移;组织病理学检测F1代测交成年斑马鱼精巢特征。结果成年F1代测交雄性斑马鱼精巢发育及功能被抑制,同时存在间质(Leydig)细胞增生与精子数量减少的病理损害特征。DBP(0.6和1.8 mg/L剂量组)暴露后F1代出现小头小眼畸形、弱色素沉着、心包及卵黄囊水肿和脊椎异常等;24hpf自主运动(抽动)减弱,且随DBP浓度增加呈现明显的剂量-效应关系(R^2=0.8929,P<0.05);72hpf心率随着DBP暴露浓度增加逐渐降低,呈现明显的剂量-效应关系(R^2=0.8999,P<0.05)。胚胎整体原位杂交结果显示,1.8 mg/L DBP暴露组的F1代测交斑马鱼发育至24hpf时,PGCs分布异常,部分PGCs没有迁移到生殖脊部位。结论DBP暴露导致成年雄性斑马鱼的生殖异常和胚胎的发育异常可以传递至F1代,可能通过PGCs的迁移异常干扰生殖发育。

摘要：【目的】探讨nanos基因在家蚕Bombyxmori胚胎发育中的表达模式,为进一步研究该基因在家蚕胚胎发育中的功能奠定基础。【方法】根据本实验室提交到GenBank中家蚕nanos的cDNA序列(登录号EF647589)设计引物,扩增出了一条长684bp的编码片段,对该片段进行了克隆和表达,亲和纯化表达的蛋白并免疫新西兰大白兔制备抗体。Western blot检测家蚕早期胚胎nanos的表达情况,荧光定量PCR检测nanos在整个家蚕胚胎发育中的表达情况。【结果】克隆并表达了一条长684bp的编码片段,得到了分子量约33kD的融合蛋白。用制备的抗血清对家蚕早期胚胎蛋白的Western blot检测表明,nanos在此阶段基本是恒定表达。荧光定量PCR结果显示刚产的卵中nanos的表达量最大,第2天开始急剧下降,此后到第10天表达量几乎没有变化。【结论】本实验克隆的nanos是家蚕中的一个同源物,该基因在家蚕胚胎发育中的表达模式与蜜蜂等有很大的不同,反映了昆虫生殖细胞形成机制的多样性。

摘要：目的：应用原始生殖细胞进行全能干细胞的研究具有与胚胎干细胞同样广阔的前景,尤其适合于难以从囊胚内细胞团中分离培养胚胎干细胞的动物。但胚胎生殖细胞体外培养条件一直是制约这方面发展的瓶颈。实验设计了体外有效扩增小鼠原始生殖细胞的方法,拟搭建稳定高效的原始生殖细胞培养平台。方法：实验于2006-10/2007-08在重庆医科大学组织胚胎学教研室重庆市生物化学分子药理学重点实验室完成。①实验材料：清洁级昆明孕鼠由重庆医科大学动物实验中心提供,见阴栓计为0.5d胚龄,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：取胚龄8．5d胎鼠尾端尿囊及周围组织，取胚龄9．5～10．5d胎鼠后肠及周围组织，取胚龄11．5d，12．5d胎鼠生殖嵴及周围组织，分别经0．25％胰酶一0．02％EDTA消化并接种于0．1％明胶包被的培养皿中。比较不同妊娠时间点取材对原代、F1代胚胎生殖细胞克隆形成的影响。采用SSEA-1免疫组织化学法计数细胞阳性率，计数胚胎生殖细胞克隆联合MTT法比较胚龄11．5d，12．5d两个时间点原始生殖细胞的增殖能力。比较上述两种取材培养方法对胚龄11．5d，12．5d原始生殖细胞扩增的影响。采用碱性磷酸酶染色、免疫组化检测SSEA一1、免疫荧光检测Nanog，体外分化实验鉴定分化能力。结果：①胚龄11．5d，12．5d胎鼠原代和F1代集落形成率较胚龄8．5～10．5d高，扩增效率显著提高（P〈0．01）。②免疫组织化学法检测分离的胚龄11．5d，12．5d原始生殖细胞SSEA-1阳性率差异不显著（P〉0．05）。原代第3天克隆计数显示，胚龄11．5d胎鼠高于12．5胚龄胎鼠（P〈0．01），MTT数据显示11．5胚龄组稍高于12．5胚龄组。③两种方法对胚龄11．5d，12．5d胎鼠胚胎生殖细胞集落形成无显著性差异（P〉O．05），但生长方式有所不同。④克隆胚胎生殖细胞呈典型的胚胎干细胞样集落生长，能稳定传代；碱性磷酸酶、SSEA-1、Nanog表达强阳性：体外能分化为囊状类胚体。结论：胚龄11．5d和12．5d胎鼠，尤其是胚龄11．5d胎鼠扩增原始生殖细胞效率较高，在这两个时间点运用与周围组织共培养法和生殖嵴分离培养法均适宜。