摘要：根据克隆得到的中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)CYP4基因开放阅读框设计引物,构建了中国对虾CYP4基因原核表达载体p28a-CYP4,并对重组菌株Rosetta/28a-CYP4的原核表达条件进行了优化。结果表明:p28a-CYP4转化Rosetta后可实现CYP4基因的原核表达,SDS-PAGE分析显示其在56.0 kDa处有显著诱导条带;通过对诱导温度、IPTG浓度、诱导时机(OD600)及诱导时间的优化表明,重组菌株Rosetta/p28a-CYP4的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1.2 mmol/L,最佳诱导时机及诱导时间分别为0.59和6 h。

摘要：【目的】研究对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)囊膜蛋白sVP53B克隆、表达、纯化及抗血清制备。【方法】根据WSSV囊膜蛋白基因序列,设计引物,PCR扩增出功能序列(Svp53B),构建到pET-16b载体后,转化至大肠杆菌Rosetta 2诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting检测优化表达。表达产物采用Ni-NTA琼脂糖磁珠进行纯化、割胶回收融合蛋白,以纯化的Svp53B-his为抗原,免疫兔子获得多克隆抗体,通过间接ELISA检测抗体的效价。【结果】构建重组质粒p ET-16b-Svp53B,在大肠杆菌Rosetta 2中以1 mmol/L IPTG诱导表达量最高,主要以包涵体形式表达。纯化包涵体蛋白免疫兔子,获得多克隆血清,效价达到1:150 000。【结论】原核表达并纯化得到高纯度的WSSV囊膜蛋白s VP53B,制备的兔源多克隆血清亲和力高、特异性好,这对后期进一步研究VP53B与经口侵染相关功能奠定了基础。

摘要：收集某猪场1例发病种公猪的睾丸病料,处理后采用细胞培养与乳鼠脑内接毒相结合的方法盲传并结合RT-PCR方法分离鉴定,命名为乙型脑炎病毒(JEV)贵州分离株(GZ株),然后根据GenBank登录的日本乙型脑炎病毒SA14和SA14-14-2株全基因序列设计并合成1对扩增E基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增出JEV贵州分离株E基因,并将E基因克隆到pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-E,经双酶切鉴定、测序及序列分析鉴定后,再将E基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建乙脑病毒E基因原核表达质粒pET-32a-E,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E转化至宿主菌BL21(DH3)中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,得到了约59ku条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化和浓缩目的蛋白,并将其加入弗氏佐剂后免疫小鼠,免疫后采血检测抗体。结果显示:乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为乙型脑炎亚单位疫苗的研究奠定了基础。

摘要：目的克隆并表达抑制新城疫病毒(NDV)繁殖的九肽(Nonapeptide)及其突变体基因。方法设计并合成Non-apeptide2串联体及其突变体基因,克隆于质粒pUC18,经酶切回收目的基因,与经相同酶切的表达载体pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌落,抽提质粒进行鉴定。IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定,证明构建正确。阳性重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约29000处可见一明显条带,与理论值相符。Nonapeptide 2及其突变体蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的41%和37%。Western blot结果显示两种蛋白均具有良好的反应原性。结论已成功克隆并表达了抗NDV繁殖的Nonapeptide及其突变体基因。

摘要：根据GenBank已登录的PPRV基因组序列,设计并合成2对特异性引物,以PPRV疫苗株基因组为模板,经RT-PCR扩增获得N和M基因并进行序列分析,再将2个基因插入到原核表达载体pET-28a中,经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE和Western blot检测。成功克隆PPRV疫苗株N和M基因,重组菌经IPTG诱导后表达分子质量为57.7ku N蛋白(核衣壳蛋白)和38.1ku的M蛋白(基质蛋白),2个蛋白均能与小反刍兽疫阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。

摘要：丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine Protease Inhibitor,SPI)通过抑制靶蛋白活性参与调节内源蛋白平衡,并在植物发育、防御机制中发挥重要作用。该研究利用RACE技术克隆获得百子莲(Agapanthus praecox ***)ApSPI基因全长序列,构建了*** Transetta(pET-32a-ApSPI)重组菌株,并检测重组菌株在不同非生物胁迫下的耐受性。结果显示:(1)ApSPI基因全长为652 bp,开放阅读框为366 bp,编码122个氨基酸。(2)ApSPI蛋白含有一个N端信号肽和一个典型的Kazal结构域,是一种Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂。重组蛋白最佳诱导温度为37℃,诱导时间6 h,IPTG浓度为0.1 mmol·L^-1,且主要以可溶性形式存在。(3)重组菌非生物胁迫耐受性研究发现,重组菌Transetta(pET-32a-ApSPI)对NaCl(200~400 mmol·L^-1)、KCl(200~400 mmol·L^-1)和PEG6000(5%)的耐受性明显高于对照菌株Transetta(pET-32a)。研究表明,过表达ApSPI蛋白增强了大肠杆菌对盐、干旱胁迫的抗性,为进一步研究ApSPI在植物抗逆中的作用奠定了基础。

摘要：根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气溶素(aerolysin,Aer)基因的序列设计引物,以来自湖北的鱼源***分离株为模板扩增出aer基因的ORF序列,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定。测序结果表明,***的aer基因的系统进化树中国内菌株聚为一支,国外菌株聚为一支。通过pET-32a(+)载体构建Ah15株aer基因的表达载体pET32a-15,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约72.2ku相吻合的融合蛋白带,且以包涵体形式存在。浓缩后的包涵体蛋白免疫新西兰大白兔获得了重组蛋白的抗血清,Western blot结果显示,兔抗血清可以识别***的重组毒素,说明该基因的重组蛋白具有很好的免疫原性,可作为***基因工程疫苗研制的候选基因。

摘要：参照GenBank公布的鹅源新城疫病毒NA-1株F基因(DQ659677)的核苷酸序列设计1对引物,通过PCR扩增F基因全长,将其克隆到pET-22b(+)载体中,构建了原核表达载体pET-22b(+)-F,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化了重组蛋白,Western-blot证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为0.21μg/孔,建立了检测鹅源新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。

摘要：参照NDVLa Sota株核酸序列(AF077761)设计1对引物,利用RT-PCR扩增F基因并得到了长为1 700 bp的片段,将其克隆到pGEM-T easy vector中,经酶切鉴定和测序后克隆进原核表达载体pET-32a,将重组表达质粒转化BL21(DE3),在IPTG诱导下表达约83 kd的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blotting检测证实该基因片段获得高效表达且表达产物具有免疫学活性。

摘要：目的克隆林氏扇头蜱Boophilin-H2基因,构建重组表达载体,在大肠埃希菌中表达Boophilin-H2重组蛋白,并检测其抗凝活性。方法通过设计特异性引物,以林氏扇头蜱饱血成蜱RNA反转为cDNA为模板,PCR扩增Bo⁃ophilin-H2基因片段,克隆、连接到质粒pSmart-I,构建重组表达载体pSmart-I/Boophilin-H2,BamHⅠ和XhoⅠ双酶切验证重组表达载体,将表达载体转入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷低温诱导表达,Ni-NTA Resin纯化重组蛋白,12.5%SDS-PAGE检测重组蛋白表达及纯化情况,使用3.8%枸橼酸钠采血管收集新西兰大白兔股静脉血,离心分离吸取上层血浆,利用体外凝血四项检测盘检测重组蛋白抗凝活性。结果扩增并克隆出林氏扇头蜱Boophilin-H2基因片段387 bp,构建出原核表达载体pSmart-I/Boophilin-H2,双酶切验证载体构建成功,转入大肠埃希菌中经0.8 mmol/L IPTG诱导表达16 h,SDS-PAGE检测表明重组蛋白表达在上清液中,主要以可溶形式存在,编码的Boophilin-H2重组蛋白大小在35000左右,纯化Boophilin-H2重组蛋白进行抗凝活性检测表明,重组蛋白能显著延长活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT),并具有浓度依赖性,重组蛋白对凝血酶时间、凝血酶原时间、纤维蛋白原凝血时长的影响差异无统计学意义。结论本研究构建Boophilin-H2表达载体,其表达产物具有很强的APTT抗凝活性,揭示了重组蛋白发挥作用在内源凝血途径,可能作用于内源性凝血因子Ⅷ、Ⅺ、Ⅻ从而阻止血液凝固,为进一步蜱类防控疫苗和抗凝血药物的研发提供了参考依据和理论基础。