摘要：从烟台海滨水域分离出一株海洋单细胞微藻。通过形态学鉴定和18S rDNA 基因序列分析确定该株真核微藻属于四爿藻属(Tetraselmis sp.),命名为138号藻种。利用Central Composite 法的Box-Behnken实验设计优化了此藻株的原生质体备条件。获得了以原生质体制备率为目标函数的三元二次回归方程:Y1=88.30-0.19X + 2.44X2 + 2.28X3 - 0.95X1X2 - 3.13X1X3 + 3.78X2X3 - 9.85X1^2 - 7.95X2^2 - 7.22X3^2。得到最优制备条件:混合酶比例纤维素酶:果胶酶为5:2;混合酶浓度为4.5%(纤维素酶浓度为2.7%,果胶酶浓度为1.8%);缓冲液pH为6.4,最高理论制备率81.5%。经过3次平行试验,实际得到的原生质体制备率为80.5%,与模型预测值的误差为1.24%。绿色荧光蛋白报告基因瞬时表达检测了所制备原生质体的转化能力。

摘要：通过单因素及正交试验优化,拟建立高粱红曲菌M-3的菌丝高效制备和再生原生质体的优化方法。试验结果表明,在以1.0mol·L^(-1)山梨醇(pH8.0)为高渗透稳定液,以纤维素酶(0.3%)和蜗牛酶(0.3%)为裂解酶的条件下,考查不同酶解时间、酶解温度及酶解pH等单因素对原生质体形成与再生的影响;在单因素试验的基础上,采用正交设计试验确定原生质体制备与再生的最佳工艺参数为:酶解时间2h、pH值为6.0、温度32℃,在此工艺条件下,原生质体形成数为3.000×10~6个·mL^(-1),原生质体原生质体再生率为19.33%(再生菌落数为5.80×10~5个·mL^(-1))。

摘要：以香菇菌株YJ-01为试材,以原生质体产量与再生率为指标,探究酶种类、酶解时间、酶解温度、pH、稳渗剂种类、稳渗剂浓度及菌丝菌龄等7个因素对原生质体产量与再生率的影响。通过单因素试验,选出了4个因素(酶解温度、酶解时间、菌龄和稳渗剂浓度)利用四因素二次通用旋转设计进行优化。结果表明:(1)YJ-01原生质体最佳制备条件:pH 5.0,0.5 mol/L MgSO_4溶液作稳渗剂,对5日龄菌丝体于28℃条件下酶解3 h。各因素对原生质体产量的影响作用依次为酶解温度>酶解时间>菌龄>稳渗剂浓度。(2)YJ-01原生质体最佳再生条件为,当p H 5.5,以0.5 mol/L蔗糖溶液作稳渗剂,对6.5日龄菌丝体在27.8℃酶解2.9 h。各因素对原生质体再生率的影响作用依次:稳渗剂浓度>酶解时间>菌龄>酶解温度。

摘要：以金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)再生苗的幼嫩叶片为实验材料,以原生质体活力率为评价指标,用正交试验设计对原生质体制备过程中的纤维素酶浓度、果胶酶浓度、离析酶浓度和酶解时间四个关键因素进行最佳组合筛选,发现当纤维素酶为9.5 mg/m L、果胶酶为5.0 mg/m L、离析酶为6.0 mg/m L、酶解时间为3.0 h的组合条件下,制备的原生质体活力率最高,为94.42%。在此基础上,采用高钙高pH值结合PEG4000诱导法进行原生质体融合研究,以高活力的赤水和瑞丽金钗石斛原生质体为材料,以异核体融合率为评价指标,用响应面法优化设计对原生质体融合过程中的PEG浓度、CaCl_2浓度、pH和融合时间四个因素进行最佳组合筛选,发现当PEG4000浓度为38.41%、CaCl_2浓度为0.44 mol/L、pH为9.26、融合时间为28.87 min的组合条件下,异核体融合率达到最高,为0.924%。同时,响应面法分析还发现,PEG浓度和CaCl_2浓度之间、PEG浓度和pH之间、CaCl_2浓度和融合时间两个因素共同对异核体融合率有显著影响。此外,响应面分析还发现,当pH为9.26时,PEG浓度、CaCl_2浓度和融合时间的值在一定范围内变化并不会显著影响异核体融合率的值,数值均维持在0.94%左右。该研究完善了金钗石斛原生质体制备和融合的技术体系,为金钗石斛种质资源的保护、拓展和新品种选育提供了实验材料,为其他近缘物种的相关研究提供了实验参考。

摘要：采用响应面法优化纤维堆囊菌So ce 90的原生质体制备条件。选择溶菌酶浓度,酶解时间和酶解温度作为考察因子,在单因素试验的基础上,采用Box-Benhnken中心组合设计方法进行三因素三水平试验设计。以原生质体生成率作为响应值,进行多元二次响应回归分析,得出纤维堆囊菌So ce 90原生质体制备的最佳条件为:溶菌酶浓度1.40 mg/mL,酶解时间为160min,酶解温度为30℃,响应模型预测的原生质体最高生成率为87.78%,在最优的条件下进行验证试验,得到原生质体生成率为86.23%,与预测值间的相对误差为1.76%,表明采用响应面法优化纤维堆囊菌So ce 90原生质体的制备条件是可行的。

摘要：以高粱幼苗为材料,利用1%的纤维素酶Cellulose R10和0.75%的果胶酶Macerozyme R10处理高粱幼茎,对比不同的酶解时间,发现酶解7h原生质体浓度最高、质量最佳。以经过氯化铯密度梯度离心法获得的高纯度质粒对获得的原生质体进行转化,用激光共聚焦进行荧光观察,结果显示,GFP和YFP在全细胞表达。本研究首次建立了高粱以高粱幼茎为材料的原生质体制备及转化体系,其方法简单、高效,可以用于高粱基因功能研究。

摘要：采用正交拉丁设计对影响木霉菌原生质体制备和再生的条件进行了系统研究。结果表明:木霉菌原生质体制备受到缓冲体系、渗透压稳定剂、木霉菌菌龄、细胞壁降解酶的种类、酶解时间和再生培养基的影响,而不受木霉菌株系的影响。其中以磷酸缓冲体系和蔗糖为渗透压调节剂的降解体系为最佳,木霉菌菌龄以培养20h较好,崩溃酶对木霉菌细胞壁的降解效果好,酶解时间以4h为最佳,再生培养基以基础培养基和NaCl为渗透压调节剂为最佳。

摘要：[目的]优化紫球藻细胞原生质体制备条件。[方法]利用Box-Benhnken的中心组合实验设计,进行三因素三水平的实验设计。[结果]得到二次回归方程:Y=55.10+5.19X1-0.075X_2+1.76X_3-0.85X_1X_2-3.13X_1X_3-4.20X_2X_3-9.09X_1~2-6.66X_2~2-7.49X_3~2,确定了混合酶浓度(X1)、纤维素酶和果胶酶的比例(X2)和pH(X3)三因素对紫球藻原生质体制备率(Y)的组合效应,得到了混合酶浓度2.2%、纤维素酶与果胶酶体积比2∶3、pH 7、渗透压稳定剂为0.2mol·L-1 KCl、30℃下轻微振荡、酶解6h的最优制备条件,在此条件下得到68.5%的原生质体制备率。[结论]本研究提高了紫球藻原生质体的制备率,能够满足后续基因工程和遗传育种研究的需要。

摘要：栓孔菌属(Trametes)真菌菌株漆酶同工酶种类多,产漆酶优势独特,是重要的工业漆酶来源之一.为建立方便快捷的获得同核体菌株的方法,以高产漆酶耐热毛栓孔菌Trametes trogii S0301为研究对象,在利用原生质体再生技术得到再生单菌、通过PCR克隆获得该菌株交配型基因b1、b2位点序列的基础上,设计b1、b2交配型基因特异引物并对各再生菌落中不同交配型基因类型进行识别,结合经典的锁状联合显微镜观察,共从45个性状稳定的再生菌株中获得了19个b1b2型异核体菌株,26个b1型同核体菌株,同核体菌株检出率为57.8%,且PCR鉴定结果和锁状联合观察结果一致.此外,还发现b1型同核体菌株菌丝细、菌落稀疏,有更快的蔓延速度,在不添加漆酶诱导剂Cu2+的固体培养基中表现出更强的产漆酶能力.本研究表明PCR克隆交配型基因的方法适用于同核体菌株的快速鉴定,同时b1型同核体菌株具有产漆酶的优势.