摘要：目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量pcr(real time fluorogenic quantitative pcr)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量pcr检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量pcr检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量pcr检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。

摘要：为了建立可同时检测鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)和锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus,KHV)的检测方法,本研究根据CEV P4a基因保守序列,对英国环境、渔业水产养殖研究中心(Center for Environment,Fisheries and Aquaculture Science,CEFAS)设计合成的引物序列进行优化,合成1对特异性引物和1条用FAM荧光基团标记的TaqMan探针;根据KHV ORF7基因保守序列,设计筛选1对特异性引物和1条用VIC荧光基团标记的TaqMan探针。优化反应条件,建立了CEV和KHV双重实时荧光定量pcr检测方法。结果显示该方法特异性强,与其它水生动物病毒无交叉反应;灵敏度高,对CEV和KHV的检测限均为15拷贝数/μL;组内重复与组间重复的平均变异系数小于3%。本研究建立的方法具有快速、特异、敏感等优点,可用于CEV和KHV的快速检测。

摘要：目的:建立双重实时荧光定量pcr检测橙汁饮料中橙与橘成分的方法。方法:通过设计和筛选橙、橘成分的引物和探针,检测水果寻找橙和橘的荧光扩增规律,利用橙和橘在FAM/VIC两个荧光通道上的比值差异来判定橙、橘成分。采用模拟橙汁掺杂柑橘汁试验验证方法检测的最低掺杂比例,对市售橙汁饮料进行检验来验证方法可行性。结果:纯橙水果在FAM和VIC两通道均有荧光扩增曲线,FAM/VIC通道荧光比值在0.5±0.2的范围内,而纯橘水果仅在FAM通道有很强的荧光扩增曲线。模拟掺杂试验中,可以检测出橙汁中掺有10%及以上的柑橘汁。结论:该方法能够检测橙汁饮料中的橙和橘成分,可用于市售橙汁饮料的鉴伪。

摘要：目的 建立单管检测人维生素D受体（VDR）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的双重实时荧光定量聚合酶链反应（dual real-time pcr）的方法。方法 以GAPDH基因为内参,采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物及Taq Man探针,进行pcr扩增检测VDR基因。将VDR及GAPDH扩增产物片段纯化后克隆构建成重组质粒,作为定量检测基因表达的标准品,并用于分析该方法的灵敏度和重复性。结果 pcr扩增产物经测序分析证实为VDR及GAPDH特异性片段;该方法检测VDR与GAPDH灵敏度达40拷贝/μL;线性范围为4.00×10~1~4.00×10~5拷贝/μL;决定系数R2分别为0.998、0.999;扩增效率E分别为96.10%、85.15%;批内变异系数（CV）分别为0.09%~1.21%、0.35%~0.88%;批间CV分别为0.17%~0.51%、0.51%~2.46%。结论 成功建立了单管检测人VDR及GAPDH的双重实时荧光定量pcr方法,且该方法特异性好、灵敏度高、可快速高通量检测VDR的相对表达量,有效缩短时间,减小实验误差。

摘要：为建立一种可鉴别非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株与ASFV-G-ΔI177L(I177L基因缺失株)疫苗株的实时荧光定量pcr检测方法,本试验针对非洲猪瘟病毒B646L与I177L两种基因保守性高的区域,分别设计了引物和探针,通过引物、探针最佳工作浓度筛选和退火温度优化,建立了一种双重实时荧光定量pcr核酸检测方法,并验证该方法的敏感性、特异性、重复性。结果显示,该检测方法建立的标准曲线线性关系良好,R2均>0.99;对pUC57-B646L和pUC57-I177L质粒标准品最低检出限均为10 copies/μL;与其他常见猪病病原无交叉反应,特异性强;批内变异系数为0.11%~1.39%,批间变异系数为0.21%~0.96%,均小于1.4%,重复性和稳定性良好。结果表明,本试验成功建立了一种性能良好的非洲猪瘟病毒B646L与I177L基因双重实时荧光定量pcr核酸检测方法,可为临床上非洲猪瘟病毒野毒株和ASFV-G-ΔI177L疫苗株的检测和鉴别提供技术支撑。

摘要：为建立一种空肠弯曲菌和沙门菌的双重实时荧光定量pcr检测方法,根据空肠弯曲菌的保守基因hipO和沙门菌的保守基因invA分别设计合成引物和TaqMan探针,分别使用FAM、JOE作为探针报告基团,TAMRA作为探针淬灭基团。优化反应体系及条件,建立适用于检测食品中空肠弯曲菌和沙门菌的双重实时荧光定量pcr方法。结果显示,该检测方法特异性强,灵敏度高,空肠弯曲菌检测限可达10CFU/mL,沙门菌检测限达230CFU/mL。表明建立的双重实时荧光定量pcr可为实现食品中空肠弯曲菌和沙门菌的同时检测提供新方法。

摘要：旨在建立犬冠状病毒(CCoV)和犬细小病毒(CPV)双重TaqMan荧光定量pcr检测方法。针对CCoV的3′UTR与CPV的VP2设计引物与探针,通过对反应体系与条件进行优化,建立了CCoV与CPV的双重荧光定量pcr检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性、重复性验证与临床样品检验。结果:CCoV与CPV阳性参考质粒浓度在10^(2)~10^(7) copies/μL,CCoV与CPV的标准曲线R^(2)分别为0.999与0.996,线性关系良好,CCoV与CPV的最低检测限均为5 copies/μL,与其他病原无交叉反应,组内与组间的变异系数均小于1.38%,说明该方法灵敏度高、特异性强、重复性良好;对113份临床样本进行检测,与普通pcr比较,该方法对CCoV和CPV的检出率较高,分别为37.2%和40.7%。研究表明,本试验建立的CCoV和CPV双重荧光定量pcr方法检测效果良好,为相关疾病的临床诊断、流行病调查等提供了有力工具。