摘要：本研究利用L16(45)正交试验设计,对影响ISSR-PCR反应体系的5个影响因素(Mg^(2+)浓度,d NTPs浓度,Taq DNA聚合酶浓度,引物浓度及模板DNA含量)进行优化。并在50~60℃范围内摸索引物UBC845的最适退火温度,并建立了花吊丝竹的最佳ISSR-PCR反应体系:2.5 mmol/L Mg^(2+),0.25 mmol/L d NTPs,1.50 U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,80 ng模板DNA,2μL 10x Buffer,9.5μL dd H2O,ISSR-PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s;52.7℃退火30 s,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。利用优化的反应体系从100条引物中筛选出16条多态性较好的引物,该体系的建立有助于花吊丝竹种质资源遗传多样性分析和指纹图谱的构建。

摘要：【目的】对限制性位点扩增多态性（Restriction site amplified polymorphism，RsAP）标记技术进行改进，并优化了其反应体系。【方法】遵循引物设计原则，使限制性位点序列位于中间，在其3’端增加3个选择性碱基，5’端设计为10～12个碱基的随机序列，设计了14条长为19bp的限制性位点扩增多态性（RSAP）新引物。以大白菜、紫菜薹自交系及其F1、F2的DNA为模板，对新引物的反应体系进行了优化，并对其重复性和适用性进行了检验。【结果】新设计引物PCR扩增的前5个循环退火温度为35℃，后35个循环为52℃；在25μL优化反应体系中，模板DNA用量为2．0μL（20．0ng／μL）、Mg^3＋ 3．0μL（25mmol／L）、Taq酶（5U／μL）1．5U、dNTPs2．0μL（2．5mmol／L）、引物各0．6μL（10μmol／L）；新引物扩增出的谱带较原引物更多，多态性更好；只改变选择性碱基，新设计引物就能扩增出新的谱带；新设计引物的重复性、稳定性好，在荞麦和小麦品系，以及紫菜薹、大白菜及其F1、F2中，新引物均能扩增出清晰谱带。【结论】新引物适用性和重复性好，可广泛应用于其他作物的基因组DNA分析。

摘要：以大头典竹叶片为材料,采用单因素分析法和正交设计直观分析法,对影响PCR扩增效果的Mg^(2+)、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA含量这5个PCR反应体系主要成分以及退火温度和循环次数进行筛选。通过研究建立了适合大头典竹的ISSR-PCR反应体系:20μL反应液中含2.5 mmol/L Mg^(2+),0.25 mmol/L dNTPs,1.25 U TaqDNA聚合酶,0.6μmol/L引物,10 ng模板DNA,2μL 10×Buffer,10.55μL ddH_2O。相应反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性45 s,54.5℃退火30 s,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。应用建立的优化反应体系成功地筛选出16条多态性较高的引物,表明该体系具有较高稳定性、重现性、适用性,可较好地应用于大头典竹不同地理种源间的遗传多样性研究。

摘要：采用交互正交设计L64(421)对濒危植物云南红豆杉简并锚定微卫星-PCR反应体系分别进行了5因素(Taq酶;Mg2+;dNTP;DNA及引物)4水平的优化筛选,SAS软件统计分析表明:3个单因素(Taq酶;Mg2+;dNTP)和2个交互作用(Taq×Mg2+,Mg2+×dNTP)对此反应体系有显著影响作用。云南红豆杉简并锚定微卫星-PCR反应的优化体系是:在20μL反应体系中含有1×PCR buffer,Taq酶4 U,Mg2+(2.0 mmol.L-1),dNTP(0.4 mmol.L-1),DNA75 ng,引物(1.0μmol.L-1),退火温度(54℃)。交互正交设计既能快捷有效地筛选出最佳PCR反应体系,又能揭示试验因素及其交互作用对扩增的影响程度,分析结果更客观、准确,具有一定的应用价值。

摘要：本研究以硬叶兜兰为试验材料,通过改良的CTAB法提取总DNA,运用5因素4水平的正交试验设计,综合采用直观量化分析和方差分析两种方法,分析模板DNA用量、Mg2+浓度、d NTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量五个因素对cp SSR-PCR扩增的影响,比较不同组合扩增效果的差异,最终确定优化的硬叶兜兰cp SSR-PCR反应体系;并通过梯度PCR确定最佳退火温度。研究结果表明,以DNA模板用量对扩增反应的影响最大,Mg2+浓度的影响最小;较优的反应体系为:模板DNA 45 ng、d NTPs 0.2 mmol/L、引物各0.6μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.4 U、10×PCR-Buffer,总体积10.0μL。本研究采用该体系对采自滇东南7个居群的12份样本扩增验证其稳定性,并从33对引物中筛选出扩增条带清晰、具明显等位基因、特异性好的12对引物。研究结果说明该优化体系能较好地对硬叶兜兰居群个体遗传差异进行分析。

摘要：以兴安落叶松针叶DNA为模板,对影响落叶松RAPD-PCR扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立兴安落叶松RAPD-PCR反应的最佳体系。通过采用正交设计L16(45)对兴安落叶松RAPD-PCR反应的5因素(Taq酶、Mg2+、dNTP、模板DNA、引物)在4个水平上进行优化试验,结果表明兴安落叶松最佳的RAPD-PCR的反应体系(20μL)中含有模板90ng,0.5μmol·L-1的引物,1×反应缓冲液,DNTP各为0.25mmol·L-1,1U的TaqDNA聚合酶,Mg2+2.5mmol·L-1。在此基础上筛选出20个扩增稳定、多态性丰富的RAPD引物,并通过梯度PCR试验,确定了引物最佳退火温度。

摘要：以改良CTAB法提取的荔枝基因组DNA为模板,应用L25(56)正交表,研究了Taq、Mg2+、随机引物、dNTPs和DNA模板5种RAPD反应组分浓度变化对扩增结果的影响,量化分析结果表明:正交设计可以应用于RAPD反应体系的建立。用这种方法建立的荔枝RAPD-PCR优化反应体系为:25μL反应体系中含1×Buffer、2.0mmol/LMg2+、2.0UTaqDNA聚合酶、0.15mmol/LdNTPs、0.6μmol/L随机引物、25ngDNA模板。

摘要：以扁蓿豆(Medicago ruthenica)为试材,采用改良的CTAB法提取DNA,利用正交设计L16(45)探讨10×PCRBuffer(含Mg2+)、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量对扁蓿豆ISSR-PCR反应的影响,正交试验的结果采用直观分析和方差分析相结合。建立了扁蓿豆的ISSR-PCR优化反应体系,在25μL反应体系中,TaqDNA聚合酶1.5U,10×PCR Buffer(含Mg2+)2.0 mmol/L,模板DNA0.5 ng/μL,dNTPs 0.6 mmol/L,引物0.9μmol/L。同时探讨引物HZD09211的最适退火温度为52.3℃。2个不同引物对20份扁蓿豆材料DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示该体系具有较高的稳定性。

摘要：利用正交试验设计的方法,对北美驼绒藜ISSR-PCR反应的5因素(Taq酶、dNTP、引物、Mg2+和模板DNA)4水平进行试验,试验结果运用MINITAB软件进行分析,建立了适合北美驼绒藜的既稳定又谱带多的ISSR-PCR最佳反应体系,即20μL的反应体系中含有1×buffer,1.5UTaq酶,0.2mmol.L-1dNTP,0.5μmol.L-1引物,2.5mmol.L-1Mg2+和10ng模板DNA。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立,为今后利用ISSR技术进行驼绒藜属植物种质资源分类、遗传图谱构建和遗传变异奠定了技术基础。

摘要：以CTAB微量提取方法提取10个红萝卜雄性不育系A单株的基因组DNA,等浓度混合成基因池。以其为模板,用正交设计方法论定RAPD-PCR反应体系的各影响因子,用随机引物S42(5'GGACCCAACC3')优化萝卜雄性不育系A基因组DNARAPD-PCR反应体系,16次试验即可获得最佳的RAPD-PCR反应体系。