摘要：野生型ｐ５３基因在细胞增殖与分化的调控过程中起着重要作用。已有研究表明，人喉癌中存在ｐ５３基因的结构异常或表达异常。本实验根据这一特点，设计出能整合在人喉癌细胞染色体上并适宜表达的野生型ｐ５３基因反转录病毒重组体Ｐｃ５３Ｎ２Ａ。通过体外实验证明，这一重组体能够以基因替代的方式，恢复ｐ５３基因的功能，抑制人喉癌细胞的生长。

摘要：背景:钙离子在肥大细胞活化后的脱颗粒反应起重要作用。瞬时感受器电位M7(transient receptor potential melastatin7,TRPM7)是肥大细胞重要的候选通道。目的:构建携带大鼠靶向TRPM7-siRNA的反转录病毒载体并检测其对大鼠RBL-2H3细胞抗原活化的影响。方法:实验设计3个TRPM7-siRNA序列和1个无关对照序列,克隆到酶切的pSuper-retro-neo-GFP反转录病毒载体,用重组质粒pSuper-retro-neo-GFP-shTRPM7-(1,2,3)采用脂质体Lipofectamine 2000转染RBL-2H3细胞,采用Western blot检测干扰效率。筛选出最有效的pSuper-retro-neo-GFP-siTRMP7与包装质粒共转染293FT细胞生成反转录病毒并感染RBL-2H3细胞,荧光实时定量PCR及Western blot检测TRPM7-siRNA的沉默效果。检测β-氨基已糖苷酶活性探讨RBL-2H3细胞抗原活化程度的改变。结果与结论:转染后的各组细胞中siTRPM7-3转染组的沉默效率最高(P<0.05)。pSuper-retro-neo-GFP-siTRMP7-3干扰组的TRPM7基因的mRNA水平和蛋白水平显著下调,致敏后其β-氨基已糖苷酶活性明显降低(P<0.05)。结果提示,降低TRPM7基因的表达可抑制RBL-2H3细胞的抗原活化。

摘要：报道了带有人凝血因子IX cDNA的高滴度高表达安全性反转录病毒载体的构建。采用LNL6反转录病毒载体为骨架,构建了由人巨细胞病毒启动子(hCMV)驱动的反转录病毒载体LNCIX,由反转录病毒LTR启动子驱动的反转录病毒载体LIXSN,以及由LTR和CMV启动子共同控制转录的反转录病毒载体LCIXSN,分别用电穿孔方法转导PA317辅助细胞株。LNCIX和LIXSN反转录病毒载体能在离体细胞中表达人IX因子蛋白,而LC'IXSN反转录病毒载体转移到离体细胞中没有检测到人IX因子蛋白。PA317/INCIX细胞的产病毒滴度为8×10~5CFU/ml,该重组病毒感染人纤维肉瘤细胞HT1080及血友病B患者皮肤成纤维细胞(HSF),用ELISA方法分别测定这些细胞的IX因子蛋白产量,LNCIX载体在HT-1080细胞中的人IX因子平均表达量为3.3μg/10~6细胞·d^(-1);在HSF细胞中的平均表达量为2.5μg/10~6细胞·d^(-1),其中80％以上的IX因子具有凝血活性,与过去相比,提高了产病毒滴度,增加了人IX因子的平均表达量,病毒载体骨架的设计更完善,降低了产生野生型病毒的概率,提高了安全性,对于进一步开展血友病B的基因治疗具有重要的意义。

摘要：本文研究了反义核酸(Antisense Nucleic Acids)对小鼠腹水瘤病毒(SRSV),M-MuLV反转录病毒之一种的抑制作用.设计和合成了不同序列,长度和核苷酸间磷酸根有无修饰等几种脱氧寡核苷酸片段,对经SRSV感染后的宿主细胞(NIH 3T3)的生长抑制和对无病感染的3T3正常细胞的毒性作用进行了试验.发现互补于病毒RNA基因5’端引物tRNA区序列的片段和均聚体脱氧胞嘧啶寡核苷酸片段(Homooligo-dC14)效果很好,病毒感染后宿主细胞生长抑制达到90％,并且在动物身上进行毒性试验,结果表明无毒性作用.对均聚体脱氧胞嘧啶寡核苷酸片段作了感染细胞内的反转录酶活力和细胞融合试验等,结果均与对照组有明显差别;并对它的作用机制进行了讨论. 提出上述效果很好的两种反义核酸片段是两种具有很大潜力的抑制SRSV反转录病毒的化合物.

摘要：背景:骨形态发生蛋白是一种具有潜在活性的蛋白质,当骨组织损伤时其迅速增加并活性的增强,与载体复合能修复动物骨缺损,但将其用做基因治疗的研究未见报道。目的:构建表达重组人骨形态发生蛋白2基因的重组反转录病毒载体,探讨其在成骨细胞中的生物学作用。方法:根据Genbank中人骨形态发生蛋白2基因序列设计并合成骨形态发生蛋白2特异性引物,高保真PCR扩增骨形态发生蛋白2基因,同源重组法将骨形态发生蛋白2PCR片段连接与克隆载体pDNR-CMV,构成pDNR-CMV-BMP2,经酶切、PCR和测序鉴定后,将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和反转录病毒空质粒pLP-LNCX以loxP位点进行同源重组,构成反转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2,转染入包装细胞PT67进行病毒包装,并用NIH3T3细胞进行病毒滴度测定;将反转录病毒感染人成骨细胞,四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长变化,转染48h后Westernblotting检测骨形态发生蛋白2蛋白表达。结果与结论:pDNR-CMV-BMP2质粒SalI和EcoRI双酶切、PCR及测序结果均正确,重组质粒pLP-LNCX-BMP2经氯霉素及蔗糖筛选得到的阳性克隆骨形态发生蛋白2PCR结果阳性,酶切产物与预期相一致;病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后,G418筛选可得到稳定细胞克隆,其上清液中病毒滴度可达到5×108pfu;四甲基偶氮唑盐检测中反转录病毒组与正常对照组相比,72h细胞抑制率无明显差别(P>0.05),转染48h后Westernblotting可见骨形态发生蛋白2蛋白高表达。结果说明,实验成功克隆了骨形态发生蛋白2基因并构建其反转录病毒表达载体。

摘要：背景:增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白。研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达。目的:构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,并对此重组载体进行鉴定。方法:用聚合酶链反应方法从含增强型绿色荧光蛋白基因的表达载体pEGFP-N1上高保真克隆出EGFP基因,通过分子克隆技术将目的基因重组至反转录病毒表达载体pLXSN。用菌斑快速聚合酶链法筛选阳性重组子,针对目的基因插入载体的方向设计鉴别插入方向的引物,用聚合酶链反应法、限制性酶法鉴定目的基因及连接的正向性,并对pLXSN-Kozak-EGFP重组载体进行DNA测序分析。结果与结论:从pEGFP-N1载体中克隆出上游含Kozak序列的EGFP基因,目的条带大小约750bp。构建的pLXSN-Kozak-EGFP重组子经菌落PCR鉴定,750bp处有特异性条带。插入方向经PCR鉴定,350bp处有特异性条带。限制性内切酶法鉴定,750与6000bp处有特异性条带。DNA测序比对结果表明克隆的目的基因与Kozak-EGFP一致性为100%。结果提示实验成功构建了含EGFP报告基因与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,且插入方向为正向。

摘要：综述目的：动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，是发达社会中发病率及死亡率的主要原因。许多研究显示，巨噬细胞和T淋巴细胞在本病的发病机制中的多个方面起到关键作用。由于这些细胞最初来源于骨髓前体细胞，因此通过逆转录病毒转染造血干细胞对动脉粥样硬化进行基因治疗的观念已受到很多关注。本综述总结了为实现这一目标所做的最新研究进展。近期发现：通过逆转录病毒将基因导入造血干细胞的方法在临床应用中受到一定的阻碍，部分原因是由于缺乏介导基因持久的细胞特异性表达的载体。崭新的逆转录病毒和慢病毒载体的设计就可以解决这些困难，提供在动脉粥样硬化病损部位的特定细胞处表达治疗基因的途径，我们将在本篇综述中详细的介绍这方面的最新进展。我们还将根据我们的理解重点介绍动脉粥样硬化发病机理中的进展，可能提供新的基因治疗目标。小结：通过逆转录病毒转染造血干细胞对动脉粥样硬化患者进行的基因治疗虽然仍是一个长期的计划。然而，通过逆转录病毒载体使基因在特定受损细胞中表达这一技术的新近发展，使更多的有针对性的治疗策略得以发现。这种病毒载体更为我们进一步研究该病的病理机制提供了有价值的实验工具。

摘要：背景:众多的研究已证实胰岛素样生长因子1在成骨细胞的增殖、分化、基质合成中发挥重要的调控作用,并参与调节骨改建及修复的一系列过程。目的:观察人胰岛素样生长因子1基因修饰的骨髓基质干细胞对骨损伤修复的促进作用及能否构建出具有良好生物学活性的组织工程人工骨,提高骨缺损修复质量。设计、时间及地点:对比观察,实验于2004-03/2005-05在苏州大学实验动物中心完成。材料:体外将胰岛素样生长因子1基因通过反转录病毒转入骨组织工程种子细胞骨髓基质干细胞,并与具有良好生物学活性的脱钙骨基质材料复合。方法:BalB/C裸鼠15只制备颅骨8mm缺损模型,随机数字表法分为3组,每组5只。胰岛素样生长因子1转染细胞组和空载体细胞组将两种不同植入物脱钙骨基质/胰岛素样生长因子1转染细胞和脱钙骨基质/空载体细胞分别植入颅骨缺损部位,空白对照组仅造模,不进行任何干预。造模后4周处死动物,取出颅骨进行组织学观察。主要观察指标:①反转录-聚合酶链反应检测转染细胞胰岛素样生长因子1mRNA的表达。同时收集转染后细胞上清,用蛋白免疫印迹检测重组胰岛素样生长因子1的表达。②扫描电镜观察细胞/基质材料复合物共培养3,6d后的生长情况。③颅骨缺损模型大体观察。④苏木精-伊红染色观察造模后4周各组颅骨缺损的修复情况。结果:①经反转录-聚合酶链反应及蛋白免疫印迹检测,胰岛素样生长因子1基因修饰的骨髓基质干细胞中有胰岛素样生长因子1mRNA及蛋白的表达。②扫描电镜观察转染细胞与脱钙骨基质共培养3d时胰岛素样生长因子1转染细胞组脱钙骨基质材料表面已有大量细胞黏附并向深部空隙长入;6d时脱钙骨基质表面黏附的细胞处已分泌出大量胶原纤维;而空载体细胞组各时间点黏附细胞数和胶原纤维产生量则均较少。③造模后4周各组植入物周围均无明显炎症反应,胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密;而空载体细胞组植入物可推动;空白对照组骨缺损处无新骨形成。④苏木精-伊红染色可见胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密,骨折缺损区有新骨及血管形成;空载体细胞组骨缺损区新骨形成较少;空白对照组缺损未见修复。结论:胰岛素样生长因子1转染的骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合物具有较好的骨缺损修复功能。

摘要：为构建Sirtl基因低表达的LMH细胞系,根据鸡Sirtl基因的3′UTR序列设计gSmiR30、gSmiR70和gSmiR913个miRNAs,以质粒pLNCX-gSmiRn(n为30,70或91)分别过表达这3个miRNAs48h后,依次检测其对CHO-K1细胞中报告载体psiCHECH2-gSirtl-UTR672所表达的荧光素酶活性的影响以及对LMH细胞中Sirtl基因表达的干扰情况;然后选用干扰效果较好的pLNCX-gSmiR30包装的反转录病毒感染LMH细胞,以终浓度1μg·mL^-1的G418筛选稳定过表达gSmiR30的LMH-gSmiR30细胞系,荧光定量PCR和Westernblot检测Sirtl基因的表达。结果表明:人工设计的3个miRNAs可抑制含靶位点的海肾荧光素酶活性在97%以上;且LMH细胞中Sirtl的mRNA表达水平均能被这3个miRNAs下调40%以上;筛选得到的LMH-gSmiR30细胞中绿色荧光蛋白的表达率在99%以上,细胞内Sirt1基因的mRNA水平下降75%,SIRT1蛋白也明显减少。这一研究成功获得了Sirt1基因低表达的LMH-gSmiR30细胞系,为进一步研究Sirt1基因在鸡肝脏中的功能提供了一种很好的细胞模型。