摘要：目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录pcr(reverse transcription pcr,RT-pcr)技术反转录成cDNA,根据3种生物检材不同的目标基因设计3对特异性引物,进行实时荧光定量pcr扩增,通过熔解曲线测定不同的熔解温度(Tm)和不同长度的扩增片段来区分生物检材。结果血液(斑)的Tm值为(84.5±0.2)℃,片段长度177 bp;唾液(斑)的Tm值为(76.9±0.3)℃,片段长度134 bp;精液(斑)的Tm值为(88.5±0.2)℃,片段长度294 bp。结论与常规检验法比较,联合应用RT-pcr和实时荧光定量pcr技术判定检材的生物属性特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠,可应用于日常法医物证检验。

摘要：目的:建立一种高效扩增人T细胞受体(TCR)β链可变区(Vβ)基因的方法。方法:根据TCRVβ26个亚家族基因序列特点设计扩增Vβ基因的上游内引物34条、上游外引物37条,并将内、外上游引物各分为8个简并组。在恒定区(C区)设计下游内、外和测序引物各1条以及扩增Cβ基因的上游引物1条。提取细胞RNA,用PolyA介导反转录后,采用巢式pcr扩增正常人CD8T细胞TCRVβ26个亚家族基因,并用JurkatT淋巴瘤细胞作为对照。用T-easy载体克隆RT-pcr产物,对克隆基因进行测序。结果:从正常人的CD8T细胞中扩增到所有TCRVβ亚家族基因,克隆后测序与相应的参考序列同源。从Jurkat细胞扩增出TCRVβ8基因,经测序验证与文献报道一致,且最少可从10个细胞提取的RNA模板中扩增成功。结论:建立的巢式RT-pcr方法可以高效、广谱地扩增人TCRVβ基因,为进一步进行抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的TCR克隆和功能研究打下了良好基础。

摘要：通过对“一步法”RNA提取方法的改进,简化了提取程序,并保证了RNA的质量。根据马铃薯X病毒(PVX)基因序列设计合成了一对特异性引物,运用反转录pcr(RT-pcr)对PVX-RNA进行扩增,成功得到了与预期大小相一致的308 bp片段,而对照未得到任何产物,同时对反转录酶AMV用量做了不同的处理,得出AMV仅用1u仍能得到较好扩增的效果。从而建立了经济简便的PVX的RT-pcr检测体系,为PVX的防治、脱毒苗的检测提供有效手段。

摘要：目的　检测肝细胞癌组织和正常肝组织中端粒酶RNA成分 (humantelomeraseRNAcomponent,hTR)和蛋白催化亚单位 (humantelomerasereversetranscriptase ,hTERT)各自表达情况。方法　以反转录聚合酶链反应 (RT pcr)和套式聚合酶链反应 (nested pcr)分别检测肝细胞癌组织和正常肝组织中hTR和hTERT。结果　RT pcr反应不足以清晰检出hTR的设计扩增条带 ,在RT pcr基础上进行套式pcr ,则正常肝组织和肝细胞癌组织均检出hTR内引物扩增条带 ,只是在肝细胞癌组织中hTR表达量相对更高一些。hTERT仅在肝细胞癌组织中检出 ,正常肝组织中检测不到。结论　hTR在正常肝组织和肝细胞癌组织中均能检测到 ;hTERT与端粒酶活性间关系更密切 ,端粒酶的激活可能至少包括两个层次 :其一是端粒酶RNA成分的上调 ,其二是蛋白亚单位的表达。

摘要：在分析植物液泡转化酶基因保守区序列的基础上,设计1对pcr引物,以番茄(中蔬四号)叶片总RNA的反转录产物为模板,扩增出长为668 bp的cDNA片段,并克隆入pMD-18 T simple载体。测序结果表明,所获得的片段为番茄液泡转化酶基因TIV1的片段;pcr和酶切分析表明,该片段已成功定向连入到双无载体pBinAR的CaMV 35S启动子和OCS终止子间,构建成反义植物表达载体pBinAR-aTIV1;菌落pcr表明质粒成功转化入农杆菌EHA105;瞬时表达证明该反义片段对番茄叶片液泡转化酶活性具有明显的抑制效果。

摘要：根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计了套式引物,建立了RT-nested pcr检测方法。特异性试验表明,该法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明,RT-pcr可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested pcr可以扩增到10-9稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested pcr法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例,检出率达90%,明显高于RT-pcr的检出率(45%)。部分病例扩增片段的测序结果表明,CDV NP基因出现个别碱基变异。研究结果表明,建立的犬瘟热病毒RT-nested pcr方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热的快速诊断。

摘要：对一种豇豆重花叶病毒(Cowpeas evere mosaic virus,CPSMV)反转录pcr分子检测方法进行了研究。利用从美国菌种保藏中心和德国微生物毒株保藏中心引进的CPSMV标准毒株,设计了一对特异性简并引物(CPSMVf/CPSMVr),建立了CPSMVRT-pcr检测方法。该方法具有良好的扩增反应及特异性,灵敏度可达1pg的总病叶组织RNA量。CPSMV双抗夹心酶联免疫法(DAS-ELISA)灵敏度为10μg叶组织。该方法适用于豇豆等豆类蔬菜种子及种苗中对豇豆重花叶病毒的快速检测。

摘要：桑花叶萎缩病是危害桑树的主要病害之一,其病原物为类病毒(viroid)。以感染桑花叶萎缩病的桑树植株茎尖为外植体繁育无毒桑苗,可以有效控制该病的蔓延。通过正交试验对启动培养基中植物激素的添加浓度进行优化,筛选出最适合外植体生长的培养基配方为MS+0.5 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.1%PVP-40,最适合外植体生根的培养基配方为1/2MS+0.25 mg/L 2,4-D+0.1%PVP-40。根据已报道的桑花叶萎缩类病毒的核苷酸序列设计引物,对组培桑苗叶片cDNA进行RT-pcr扩增,所有样品中均没有检测到桑花叶萎缩类病毒特异条带。试验结果表明,以感染桑花叶萎缩病的桑树茎尖为外植体,通过组织培养方法可以获得健康的脱毒苗。

摘要：为建立快速检测临床1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)感染的方法,根据DHAV-1的vp1基因序列设计1对引物,以DHAV-1及其他常见的感染鸭的病毒基因组为模板,建立了DHAV-1的特异性RT-pcr检测方法;以10倍梯度稀释的DHAV-1 RNA为模板,测定该方法的灵敏度;采集江苏多地的疑似DHAV-1感染病料,提取基因组进行RT-pcr扩增,产物经测序鉴定后判断所建立方法的检测率。结果显示,建立的方法可以特异性扩增DHAV-1 vp1基因保守区360 bp的序列,最低可检测1 fg基因组模板,对临床样品检测率为100%。表明,成功建立了特异性强、灵敏度高且可以用于临床快速诊断DHAV-1感染的方法。

摘要：从加工番茄红熟果实中提取总RNA,根据已发表的多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的序列设计合成一对特异引物,经过反转录pcr,扩增出一条697bp的目的片段。通过TA克隆,把它连接到pMD18-T vector上,测序鉴定其正确性。扩增片段经Sal I和Sma I双酶切插入到表达载体pBinAR CaMV 35S启动子和OCS终止子之间,用M13测序引物和目的片段引物进行pcr扩增鉴定,构建成含有PG基因片段的反义表达载体pBinAR-aPG,为进一步对加工番茄的遗传转化奠定了基础。