摘要：以均匀设计法设计提取蓖麻变应原的实验条件,探讨了影响蓖麻饼粕中蓖麻变应原乙醇提取率的因素.研究了乙醇浓度、提取时间、提取温度及料液比等因素对蓖麻变应原提取率的影响,得到了最佳优化工艺条件.用SDS-PAGE凝胶电泳检测蓖麻变应原的纯度,紫外扫描、高效液相检测、红外光谱分析蓖麻变应原的结构,提取物以蓖麻变应原的光吸收值为指标进行检测.优选出从蓖麻饼粕中提取蓖麻变应原的最佳工艺为:乙醇浓度为85%,提取时间为8 h,提取温度为50℃,提取物料比为1∶21(W/V).用该工艺提取出的蓖麻变应原,经高效液相检测纯度达到了98%.

摘要：迄今为止，变应原特异性免疫治疗的临床疗效已得到了大量随机对照研究和荟萃分析的证实，但由于临床研究中使用的方法和试验设计存在很大的异质性，至今并未形成普遍接受的方法学标准。儿童变应性鼻炎（AR）患者接受变应原特异性免疫治疗存在着比成人更多的问题，如诊断的准确性、伦理学问题、治疗的安全性、依从性以及疾病严重程度和临床疗效的评估困难等。

摘要：目的获得粉尘螨(Dermatophagoides farinae)变应原Der f 8全长基因并构建其原核表达质粒。方法参考Gen Bank登录号为AY283295的Der f 8部分序列设计并合成引物。以粉尘螨总RNA为模板,RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段。采用5′cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得Der f 8全长序列,连接至pMD19-T载体,热转化至大肠埃希菌(Escherichia coli),挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。根据Der f 8全长序列设计并合成引物,以粉尘螨总RNA为模板进行RT-PCR扩增,产物回收后连接pCold TF载体,热转化至***,涂板过夜培养后,挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。将pCold TF-Der f 8质粒转化至*** BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。采用生物信息学软件预测Der f 8的理化特性、结构和功能,并构建系统进化树。结果以Der f 8部分序列设计的引物行RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段,长度为600 bp;5′RACE获得Der f 8剩余序列,长度为300 bp;以全长基因序列设计的引物进行RT-PCR扩增获得了Der f 8基因CDS区,长度为696 bp,测序均正确。SDSPAGE结果显示,目的蛋白为可溶性表达,相对分子质量(M_r)为81 000,与预期大小一致。序列经生物信息学分析结果显示,Der f 8全长序列与参考序列(Gen Bank登录号为AY283295)同源性为98.49%,预测其编码的疏水性蛋白具有谷胱甘肽S转移酶活性,二级结构包括α-螺旋(45.45%)、延伸主链(11.26%)和无规卷曲(43.29%)。系统进化树结果显示,粉尘螨与户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)聚成一簇。结论获得了Der f 8全长基因及其原核表达质粒。

摘要：目的获得粉尘螨变应原第5组分的编码基因（Derf5）并了解其分子特征。方法用RNAiso试剂盒提取粉尘螨总RNA，根据GenBank已公布的Derf5核酸序列设计引物，用RT—PCR扩增获得其编码基因，插入pMD19-T Simple载体进行序列测定和分析。结果获得的Derf5基因与参考序列（GenBank AY283283）同源件达97．8％，含1个完整的开放阅读框架（ORF），由132个氨基酸组成，信号肽位于1～19AA、跨膜Ⅸ域位于1-19AA，为细胞外疏水性蛋白。二缴结构由延伸主链（1．52％）、无规则卷曲（7．58％）和α螺旋（90．91％）组成。具有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点2个。其氨基酸序列与屋尘螨变应原第5组分相似率为78％。结论成功克隆了Der f5，并初步预测得其分子特征。

摘要：提取粉尘螨总RNA,根据GenBank中的序列(登录号为AY283281.1)设计并合成引物,RT-PCR扩增Mag 29全长基因,克隆至pCold TF DNA载体,转化至大肠埃希菌(***)JM109,取阳性克隆测序鉴定。将pCold TF-Mag 29质粒转化至BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证表达产物,采用生物信息学软件预测Mag 29的结构、理化特性和生物进化关系。RT-PCR产物电泳结果显示,在429 bp处有一条带,与Mag 29基因大小一致,测序鉴定表明质粒构建成功。SDS-PAGE结果显示,表达产物的全细胞、上清和沉淀物中均有相对分子质量(M r)为63 000的蛋白表达,与预测值一致,其中上清中蛋白表达量高于沉淀。生物信息学分析显示,该蛋白是由142个氨基酸组成的M r15 100的分子,二级结构由α螺旋(55.63%)、延伸主链(3.52%)和无规则卷曲(40.85%)组成,是亲水性细胞质蛋白,与热休克蛋白70家族具有较高同源性。

摘要：目的克隆和表达粉尘螨第7类变应原基因,并鉴定重组蛋白的免疫原性。方法提取粉尘螨总RNA,根据GenBank提供的Der f 7编码区(CDS)(登录号为AY 283292)序列设计特异性引物,逆转录PCR(RTPCR)克隆Der f 7基因。将测序正确的目的片段克隆至pET-32a表达载体,得到的重组质粒pET-32a-Der f 7在大肠埃希菌(***)BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过镍离子亲和层析纯化目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白表达和纯化结果,蛋白质印迹(Western Blotting)分析重组蛋白的免疫原性。结果RT-PCR结果显示,Der f 7基因片段大小约为650 bp。测序结果表明,Der f 7基因片段与已发表的粉尘螨Der f 7基因(登录号为FJ436108)同源性为99%。SDS-PAGE结果显示,重组质粒pET32a-Der f 7在BL21(DE3)中高效表达,重组蛋白相对分子质量(M r)约为23 000。Western Blotting分析结果表明,Der f 7重组蛋白可被尘螨过敏患者血清识别。结论成功构建了粉尘螨第7类变应原的原核表达载体,并获得具有免疫原性的Der f 7重组蛋白。

摘要：目的在毕赤酵母菌(Pichia pastoris)中表达德国小蠊主要变应原Blag2,以获得其可溶性蛋白。方法根据已知的Bla g 2基因序列设计带有酶切位点的引物。PCR扩增德国小蠊变应原Blag2基因,经酶切后将该基因连接到毕赤酵母真核表达载体pGAPZaA,获重组质粒pGAPZaA-Blag2,该重组质粒线性化后,经电转化法转化毕赤酵母GS115,用PCR筛选出重组子并在YPD培养基中表达。用Ni2+亲和层析法纯化重组蛋白Bla g2,用蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫学活性。结果重组质粒pGAPZaA-Blag2转化毕赤酵母GS115后进行表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)分析显示,重组蛋白Blag2表达产物以可溶性分子形式存在,相对分子质量(Mr)为45 000。培养3 d的表达量占上清总蛋白的50％。表达产物重组蛋白Blag2经Ni2+亲和层析纯化后,Western blotting分析,在约Mr 45 000处有1条明最的特异性条带,该蛋白具有免疫学活性。结论获得了真核表达的德国小蠊主要变应原重组蛋白Blag2,该蛋白以可溶性蛋白的形式分泌到培养液中,避免了原核表达的变复性过程。

摘要：目的:克隆并原核表达粉尘螨变应原第2组分重组蛋白,鉴定其变应原性,分析其分子特征,为制备用于临床诊治的变应原奠定基础。方法:提取粉尘螨Total RNA,根据国际基因库(AB195580)设计并合成引物,经RT-PCR合成Derf 2全长基因,与pMD19-T载体连接后,热转化至***109;将测序正确的Der f 2基因与pET28a(+)Vector连接,转化BL21(DE3),IPTG诱导表达;经镍琼脂糖凝胶FF亲和柱层析,收集各阶段洗脱峰用梯度透析法进行复性,Western blot鉴定重组蛋白的变应原性。用生物信息学软件预测其理化性质、空间结构,并构建分子进化树。结果:RT-PCR成功扩增获得目的基因Der f2,全长441 bp,与参考序列同源性99.3%。将构建的pET28a(+)-Der f 2质粒转化宿主菌***21诱导表达,SDS-PAGE电泳显示全细胞和沉淀物中均有蛋白表达。亲和柱层析后获得约3.86 mg重组蛋白纯品,Western blot分析表明其可与哮喘患儿血清IgE发生特异性结合。去除信号肽序列(1～17氨基酸)后,重组蛋白由129个氨基酸组成,相对分子质量为14.076,二级结构由延伸主链(30.82%),无规则卷曲(49.32%),α螺旋(19.86%)组成。该变应原可能位于线粒体,属ML域家族。序列比对显示,粉尘螨和屋尘螨、微角尘螨、梅氏嗜霉螨的相似度依次为88%、96%、83%,此四种螨在上述蜱螨变应原第2组分构建的分子进化树中聚成一簇,支持率达100%。结论:粉尘螨变应原第2组分原核表达获得成功,纯化后获得具有变应原性的重组蛋白,为进一步规模生产该变应原并用于临床诊治奠定基础;生物信息学分析初步获得了该变应原的分子特征,为进一步实验室验证指明方向。

摘要：目的:获得粉尘螨变应原第6组分编码基因并了解其分子特征。方法:根据GeneBank已公布的Derf6核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增获得其编码基因,插入pMD19-T载体进行序列测定和生物信息学分析。结果:获得的Der f6 cD-NA全长为840 bp,与参考序列同源性达96.8%,含1个完整的开放读码框。推测编码蛋白由279个氨基酸组成,信号肽序列位于1～19 aa,亲水性指数为-0.139,跨膜区域位于1～19 aa,二级结构由α-螺旋(7.17%)、延伸主链(36.56%)和无规卷曲(56.27%)组成;亚细胞定位于细胞外,N-端第6位和第11位的亮氨酸有明显的序列核输出信号;可能为糜蛋白酶,具有cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N端酰基化位点等。结论:获得了Derf6基因全长,其编码的细胞外疏水性蛋白可能具有糜蛋白酶活性。

摘要：以蓖麻饼粕中蓖麻变应原降解菌的分离、筛选及菌株的生理特性为研究对象,对挑选出脱毒效果明显的菌株进行单菌脱毒及复配脱毒研究,然后对变应原降解条件进行优化分析研究并测定其脱毒效果,采用L9(33)正交设计实验,设计不同发酵温度、发酵时间、接菌量对蓖麻饼粕中变应原的脱毒条件进行优化分析。结果表明,蓖麻变应原较佳脱毒效果的工艺参数为:发酵温度33℃,发酵时间5 d,接菌量10%。