摘要：目的:改善重组人白介素-11在原核表达体系中的可溶表达水平以及在体内的循环半衰期。方法:通过构建白蛋白结合肽融合人白介素-11重组蛋白表达载体[pET-30a(+)-ABD-rhIL11],实现融合蛋白在原核表达体系中的可溶表达;基于疏水层析、离子交换层析和凝胶层析建立从破菌上清液中纯化ABD-rhIL-11的方法;通过圆二色光谱及荧光发射光谱分析等鉴定ABD-rhIL-11空间结构,并进行体内外活性及药效学评价。结果:成功获得纯度高于95%的重组融合蛋白,体外结合实验结果表明,ABD-rhIL-11能够迅速与人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)结合;细胞增殖实验结果显示,ABD-rhIL-11与对照品活性相当;药代动力学结果显示,融合蛋白能够显著延长白介素-11在大鼠体内的循环半衰期;血小板计数实验结果显示,ABD-rhIL-11能够有效刺激大鼠血小板增殖。结论:为基于白蛋白结合肽融合策略的白介素-11药物长效设计提供了新的思路。

摘要：目的:制备GST-p60PLAD融合蛋白.方法:依据人p60PLAD氨基酸序列,根据大肠杆菌偏爱密码子进行反翻译,获得适合在大肠杆菌中表达的基因序列.根据该基因序列设计五条引物,用重叠延伸PCR法获得编码人p60PLAD的基因,进而将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌BLR(DE3)polys.经IPTG诱导表达后收集菌体,超声裂解,将上清液经GSTrapFF亲和层析柱纯化、经HiTrap脱盐柱脱盐,用SDS-PAGE进行分析.结果:成功构建重组质粒pGEX-4T-2-p60PLAD,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致.并在大肠杆菌中高表达出Mr约为34×103大小具有可溶性的目的蛋白,经亲和层析柱纯化后获得纯度很高的GST-p60PLAD融合蛋白.结论:成功制备了高纯度的GST-p60PLAD融合蛋白,为进一步探讨p60PLAD蛋白的结构和生物学活性提供必要的物质基础.

摘要：目的通过与促溶蛋白融合表达,分离、纯化获得抗菌融合蛋白,并初步评价其抗菌活性。方法将绵羊骨髓细胞抗菌肽SMAP29的N端与源自噬菌体JD010裂解酶LysPA26的C端融合设计新的抗菌蛋白(AL)。通过同源重组构建pCold-His-TF-AL表达质粒。通过Ni-亲和层析和阴离子交换层析分离纯化AL,采用平板计数法初步评价AL的抗铜绿假单胞菌活性。结果在*** BL21(DE3)中,质粒pCold-His-TF-AL能明显表达出抗菌蛋白AL,并且90%以上的AL为可溶形式分布于***破菌液的上清液中。可分离纯化得到纯度超95%的AL。0.05 mg·mL^(-1) AL在30 min内可将铜绿假单胞菌PAO1菌量降低5.55个对数单位,具较高的抗菌活性。结论通过采用Trigger Factor标签融合表达和冷休克诱导方法可实现AL的高效可溶表达,纯化的AL对铜绿假单胞菌具有明显的抗菌活性。

摘要：为了制备GST-Exendin-4融合蛋白,以本实验室构建好的pET22b-Exendin-4为模板,通过PCR扩增出Exendin-4基因,酶切克隆入pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Exendin-4。经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同浓度的IPTG和不同温度诱导下,经SDS-PAGE分析鉴定,表达出Mr约为30 kD的目的蛋白,灰度扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的29.9%,超声裂解后的上清通过Sepharose 4B亲和层析纯化、透析、除盐及冷冻干燥得到高纯度的目的蛋白。本研究成功制备了高纯度的GST-Exendin-4融合蛋白,为下一步进行目的蛋白大规模的生产打下了良好的基础。