摘要：[目的]构建抵抗shRNA的同义突变SND1慢病毒质粒,并在SND1敲低的卵巢癌细胞系中回复表达SND1。[方法]依据密码子的简并性,针对shRNA识别的序列(TCTCGTCTCAAACTCTATTTG)设计同义突变序列(TAGGTATAACTTTAACCTGCT)并通过重叠延伸PCR的方法将同义突变序列引入SND1的编码序列中,得到recombination SND1(rSND1)目的片段,与pLVX-IRES-Hyg载体连接。测序验证pLVX-FLAG-rSND1质粒序列。pLVX-FLAG-rSND1质粒与包装质粒共转染293T细胞,获得携带FLAG-rSND1的慢病毒毒粒。用慢病毒感染SND1敲低的卵巢癌SKOV3-sh SND1-2细胞株,经潮霉素B筛选后,用Western Blot检测FLAG和SND1的表达。[结果]抵抗shRNA的真核pLVX-FLAG-rSND1重组慢病毒质粒构建成功,可检测到FLAG及SND1的表达。[结论]成功构建了同义突变SND1的pLVX-FLAG-rSND1质粒并在卵巢癌细胞中回复表达,为继续研究SND1蛋白在卵巢癌中的功能奠定了基础。

摘要：目的：构建GFP-Plk1同义突变表达载体及其稳定转染细胞系。方法：设计Polo样激酶1（Plk1）siRNA序列及相对应的同义突变引物，并利用二次PCR方法扩增Plk1基因，定向克隆到pRex-EGFP-IRES-Hygro载体中，构建pRex-EGFP-rPlk1-IRES-Hygro表达载体；利用逆转录病毒感染的方法，构建HeLa/GFP-rPlk1稳定细胞系；利用免疫印迹及激光共聚焦显微镜，验证Plk1 siRNA的干扰效果及稳定细胞系的构建。结果：双酶切鉴定和测序结果表明构建的pRex-EGFP-rPlk1-IRES-Hygro正确；免疫印迹实验证明Plk1 siRNA序列可以有效抑制HeLa/GFP-rPlk1细胞中内源性Plk1蛋白的表达，但不能干扰掉外源GFP-rPlk1蛋白；在荧光共聚焦显微镜下，观察到有丝分裂的前中期和末期，GFP-rPlk1分别定位于着丝粒和中间体上。结论：构建了Plk1同义突变表达载体pRex-EGFP-rPlk1-IRES-Hygro和HeLa/GFP-rPlk1稳定细胞系，为下一步研究Plk1在有丝分裂期的调控机制提供了模型。

摘要：目的对GI.1型札如病毒进行全基因组扩增测序尝试并开展初步分析。方法利用本研究设计的GI组札如病毒全基因组5’末端通用引物及杯状病毒3’末端引物,对本实验室保存的两株GI.1型札如病毒标本进行全基因组扩增,然后进行文库构建、上机测序及序列组装。通过BioEdit软件进行序列比对分析,采用MEGA 7.0软件构建进化树进行进化分析。结果两个标本测序质量优异,测序方法具有可行性;在全基因组(WGS)、NSP基因、VP1基因及VP2基因进化树中,均归类为GI.1型;位点变异分布于各个基因片段,但VP1基因的N端保守性较好,熵值较低;大部分基因的核苷酸突变尤其是NS3、NS5及VP1基因的核苷酸突变以同义突变为主,未形成相应氨基酸的突变。结论成功地开展了对GI.1型札如病毒全基因组扩增测序及相关进化分析,为札如病毒的检测提供了新的思路。