摘要：【目的】呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是婴幼儿急性呼吸道感染的最常见原因。基于RT-ERACRISPR/Cas12a技术,建立一种RSV快速特异性的检测方法。【方法】针对RSV N基因保守区域设计合成特异性crRNA及酶促重组等温扩增(ERA)引物,筛选最佳扩增引物-crRNA组合建立检测体系;通过荧光法检测RSV核酸,确定检测方法的灵敏度及特异性。【结果】根据Cas12a的激活原理,针对A型及B型RSV分别设计合成RSV-crRNA1及RSV-crRNA2,二者混合加入检测体系,可同时检测到A型及B型RSV,并具有协同作用;实验筛选出一组最佳引物组合(RSV-F+RSV-R3J),最低检出限为5×10^(2) copies/mL,可在39℃恒温条件下,35 min内完成检测;该方法与其他核酸测试样本无交叉反应,只能检测出RSV核酸,具有较高的特异性。【结论】基于RT-ERA-CRISPR/Cas12a技术,成功建立了一种灵敏度高、特异性强、快速、低成本的RSV核酸检测方法,该方法不依赖复杂的检测仪器,任何能够提供恒温环境和检测荧光信号功能的仪器均可适用。因此,该方法适用于RSV即时检测,还可能应用于其他病原体感染的检测。

摘要：目的评价重组人干扰素α1b注射液雾化吸入治疗小儿呼吸道合胞病毒(RSV)下呼吸道感染(肺炎和毛细支气管炎)的有效性和安全性。方法采用随机、双盲、平行、安慰剂对照的加载设计方法。选择2021年2月至2022年12月来自首都医科大学附属北京儿童医院等30家临床研究中心的发病72 h内的2月龄至5岁的RSV肺炎或毛细支气管炎患儿,按1∶1分层区组随机分为2组,2组均予止咳、平喘、祛痰、退热、氧疗等基础治疗,试验组加用雾化吸入重组人干扰素α1b注射液,2.0μg/(kg·次),2次/d;对照组雾化吸入安慰剂,2次/d。通过临床症状、体征的消失时间等指标评价临床疗效,采用Kaplan-Meier方法计算临床症状和体征中位消失时间及其95%CI,采用Log-rank检验比较组间差异。通过不良反应发生情况和实验室检查评价安全性,采用χ^(2)检验比较组间差异。结果试验组和对照组分别纳入123例和122例患儿,治疗后试验组5项临床症状、体征[气促、喘息、呼吸困难(三凹征)、经皮血氧饱和度下降、精神状况异常]均消失的时间短于对照组[2.7 d(95%CI:1.9~3.0 d)比2.9 d(95%CI:2.6~3.6 d),P=0.027]。试验组呼吸困难(三凹征)的改善尤其明显,给药第1天三凹征缓解率即达50.0%(0,100%),与对照组[0(0,50.0%)]比较,差异有统计学意义(Z=2.002,P=0.025);三凹征的消失时间较对照组缩短近1 d[1.0 d(95%CI:0.7~1.7 d)比1.8 d(95%CI:1.0~2.5 d),P=0.046]。在住院时间[6.0(5.0,8.0)d比6.5(5.0,8.0)d,Z=0.675,P=0.500]、氧疗持续时间[32.0(14.0,96.3)h比39.0(24.0,83.2)h,Z=0.094,P=0.925]、治疗期间临床症状恢复率[(105/106,99.1%)比(96/101,95.0%)]及复发率[(0/106,0)比(2/101,2.0%)]等方面,虽然上述指标组间比较差异均无统计学意义(均P>0.05),但试验组均显示出临床获益的趋势。病毒定量检测结果显示,治疗后2组RSV病毒载量较治疗前均呈下降趋势,治疗2 d后试验组和对照组RSV载量较基线下降速率分别为0.90 lg copies/(mL·d)和0.25 lg copies/(mL·d),差异有统计学意义(P0.05)。2组均无药物相关的严重不良反应发生。结论重组人干扰素α1b注射液雾化吸入治疗小儿RSV下呼吸道感染安全有效,尤其对于重症患儿有更加突出的临床治疗价值。

摘要：目的:建立适用人呼吸道合胞病毒(RSV)核酸检测的逆转录等温扩增法(RT-Lamp),为基层实验室和口岸现场的快速诊断提供时效性、便捷性服务。方法:对RSV靶基因保守区用在线软件设计并筛选出一套环介导特异性引物,采用RT-Lamp技术对RSV核酸进行恒温扩增,优化反应体系和条件,并对灵敏度、特异度和试剂稳定性等指标进行验证。结果:该方法能检测出RSV-A和RSV-B两种亚型。与荧光RT-PCR法比对,RT-Lamp灵敏度为50 copies·mL^(-1),特异度检测发现流感病毒、人冠状病毒、人偏肺病毒、人腺病毒、人鼻病毒、肠道病毒EV71、肠道病毒CoxA16均无扩增反应。加速稳定性试验显示,反应体系3周内仍然稳定。临床验证中,扩增反应判读结果时间跨度在35 min以内,总体符合率为91.7%(55/60),与RT-PCR方法比较差异无统计学意义(P=0.65)。结论:RSV RT-Lamp检测方法准确性良好,且快速简便,为进一步开展大样本诊断准确性研究提供了基础。

摘要：目的制备呼吸道合胞病毒F蛋白的融合前构象(pre-F)mRNA疫苗,进行可行性验证。方法对抗原基因进行密码子优化设计,分别连接至pGEM-3Zf-N3载体上,通过质粒线性化、体外转录、纯化和Cap1加帽处理,得到功能性mRNAs。在转染至293T细胞后,利用Western blot和间接免疫荧光试(IFA)来确定目标蛋白的表达情况。通过微流控装置制备LNP/mRNAs疫苗免疫C57BL/6小鼠,检测小鼠血清中抗原特异性IgG抗体效价,评估免疫效果。结果成功构建重组质粒Pre-F-GCN4t和mDS-Cav1,通过双酶切验证条带符合预期大小。表达目的抗原大小为57.57 ku和64.35 ku。成功检测小鼠血清中抗原特异性IgG抗体,Pre-F-GCN4t免疫组的效果优于mDS-Cav1组,3次免疫较2次免疫提升了2倍,抗体效价最高可达1∶4×10^(4)。结论两种抗原设计模式均具有可行性,Pre-F-GCN4t的设计方式对于激活机体的体液免疫应答更有优势,mRNA疫苗无需体内转录,为呼吸道合胞病毒mRNA疫苗的优化设计提供理论基础。

摘要：目的开发候选的呼吸道合胞病毒融合蛋白(Respiratory syncytial virus fusion protein,RSV-F)信使核糖核酸(Messenger ribonucleic acid,mRNA)疫苗,初步评价在小鼠中的细胞和体液免疫应答。方法选择4个编码RSV A2毒株全长F蛋白的基因序列,在体外设计RSV_(A2)-F突变体(WT_(A2)-F、DS-CAV1-Tric、SC-DM和DS2)mRNA疫苗,利用免疫印迹法鉴定在人胚肾(HEK-293)细胞中的表达;在采用该4种mRNA疫苗和RSV-F疫苗免疫小鼠2剂次(间隔2周)后12d检测血清γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)、特异性免疫球蛋白(IgG)抗体和中和抗体水平。结果4种RSV_(A2)F突变体mRNA疫苗均在HEK-293细胞中检测到表达。在小鼠免疫2剂次后,WT_(A2)-F mRNA疫苗组IFN-γ和IL-4水平显著高于RSV-F疫苗组;WT_(A2)-F mRNA疫苗组和RSV-F疫苗组均诱导特异性IgG且抗体水平无显著性差异,但前者诱导的中和抗体水平显著高于后者;post-F构象的WT_(A2)-F mRNA疫苗组与pre-F构象的mRNA疫苗组(DS-CAV1-Tric、SC-DM和DS2)均诱导特异性IgG抗体,但各mRNA疫苗组IFN-γ、IL-4和中和抗体水平均无显著性差异。结论RSV_(A2)F突变体mRNA疫苗在小鼠体内可诱导强烈的细胞和体液免疫应答,可作为潜在的RSV候选疫苗进一步研究。

摘要：目的建立一种快速、准确诊断人呼吸道合胞病毒(hRSV)早期感染的实时荧光定量PCR检测方法。方法以hRSV最保守的N基因序列为参考,设计两对特异的引物和一条TaqMan荧光探针,在LightCycler定量PCR检测仪上对93例下呼吸道感染患儿进行hRSVRNA检测,并与病毒分离培养、常规PCR、巢式PCR方法和ELISA法相比较。结果以PCR模板浓度来定义,该方法线形范围为1×102￣1×107cDNAcopies/μl,灵敏度达1×102cDNAcopies/μl,和巢式PCR相同,比常规PCR高10倍。用人脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、柯萨奇病毒2型、甲型、乙型流感病毒、腺病毒7型作对照,均无预期扩增产物和荧光的产生;该方法在LightCycler和Rotor-Gene两种仪器上的定量结果具有一致性;采用该法对93例患儿行FQ-PCR检测出阳性44例(43.9%),ELISA方法检测阳性4例(4.3%),两者相关性不高。hRSV浓度的高低与患儿临床症状之间的关系不是很明显。结论该方法可快速、灵敏、特异、定量检测hRSV,在hRSV感染的早期诊断和疗效监测方面具有良好的应用前景。

摘要：目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的TaqMan~实时定量RT-PCR检测方法。方法根据GenBank中RSV相关序列,以A、B亚型毒株基因组保守区域设计并合成RSV特异性引物和探针,采用体外转录RNA标准品,建立TaqMan~实时定量RT-PCR方法,同时验证方法特异性、检测范围、灵敏度和精密度。采用建立的方法检测50份下呼吸道感染患儿的痰样品。结果 RNA标准品建立的标准曲线R2> 0. 99,扩增效率在90%～110%之间。建立的方法可特异性扩增RSV Long株和RSV A2株核酸样本,IFA和HPIV-3核酸样本均无扩增;最高可检测到1. 3×10~9 copies/μL的RNA标准品,最低可检测到单拷贝的RNA标准品;4名实验员检测同一样品Ct值的试验内CV小于1. 72%,试验间的CV在2. 44%～3. 39%之间。50份下呼吸道感染患儿痰样品中,24份为RSV阳性,阳性率为48%。结论成功建立了RSV的TaqMan~实时定量RT-PCR方法,且该方法快速、特异、灵敏,可用于临床样本中RSV的有效检测。

摘要：呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是引起婴幼儿和老年人下呼吸道感染如支气管炎和肺炎的常见病原体,导致患者住院治疗甚至死亡。虽然RSV疫苗的研究已有近60年历史,但依然没有商品化的疫苗可用。近年来,随着RSV分子生物学研究的深入和新型疫苗设计策略的应用,RSV疫苗研究进展迅速。目前正在研制多种针对不同免疫对象的候选疫苗,包括减毒活疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗和纳米颗粒疫苗等,其中亚单位疫苗和纳米颗粒疫苗适用于孕妇和老人,减毒活疫苗、载体疫苗和部分亚单位疫苗有望用于婴幼儿。本文介绍了RSV的生物学特性、RSV疫苗研究面临的困难和正在进行临床试验的RSV候选疫苗的研究进展,为RSV疫苗的研发提供参考和借鉴。

摘要：目的进一步证实RSV感染的大鼠气道上皮细胞(RTECs)能够通过表达胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP),进而影响髓系树突状细胞(m DCs)的成熟和功能。方法设计合成针对大鼠TSLP基因的siRNA,并对RTECs进行预处理以抑制TSLP表达,随后RSV感染经过si TSLP预处理的RTECs。同时分离、培养扩增大鼠m DCs,采用Transwell系统将RTECs和m DCs共培养。最后m DCs通过Real time PCR和流式细胞术检测成熟标志物和Th2细胞因子的表达。结果 TSLP的表达受到抑制后,与感染RSV的气道上皮细胞共培养的m DCs其表面分子CD86和MHCⅡ表达水平受到抑制,而CD80变化不明显;TARC和OX40L的表达受到抑制,TNF-α表达增高。结论 TSLP基因沉默实验的结果证实了源于感染RSV的气道上皮细胞的TSLP对m DCs的作用,为进一步研究RSV在哮喘发病中的作用奠定了基础。

摘要：目的:研究呼吸道合胞病毒(RSV)对细胞因子信号抑制因子(SOCS)3,Toll样受体(TLR)3、TLR4 mR-NA表达影响,探讨SOCS3在病毒感染上皮细胞后对Ⅰ/Ⅱ型细胞因子的调节效应。方法:设计人SOCS3特异小干扰RNA(si-RNA),转染上皮细胞A549,RSV感染后不同时段,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测细胞不同时间点细胞SOCS3、TLR3、4 mRNA的表达,ELISA法检测培养上清中干扰素(IFN)-β和白细胞介素(IL)-8的浓度。结果:RSV感染上调A549细胞TLR3、4和SOCS3 mRNA的表达。SOCS3在感染后1 h升高,2 h达到峰值,分别为0 min的2.1倍和6.2倍(P<0.05),随后逐渐恢复至基础水平;TLR3、4在感染后2 h增加,并在24 h内持续表达较高水平。IL-8于24 h开始增高,24 h较基础水平增加25倍;IFN-β虽增高,但与基础水平无统计学差异。抑制SOCS3,对TLR3、TLR4 mRNA无显著性影响,但早期上调IFN-β的表达,IL-8虽有增高,但显著低于对照组。结论:RSV感染早期通过上调SOCS3表达调节上皮细胞差异表达Ⅰ/Ⅱ型细胞因子。