摘要：为克隆和原核表达安氏隐孢子虫囊壁蛋白(COWP)的部分编码基因(AB),本研究根据COWP基因序列设计引物,RT-PCR扩增目的基因AB,从而构建重组原核表达质粒pET-AB。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE以及western blot鉴定。回收并纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠,检测细胞免疫和体液免疫水平。SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白约为16 ku,可以被HRP标记的抗组氨酸抗体和安氏隐孢子虫免疫的小鼠血清识别。经重组蛋白免疫的BALB/c小鼠抗体水平以及CD4+和CD8+的值均差异显著(p<0.05),表明获得的重组蛋白具有一定的免疫原性。

摘要：为了建立敏感、稳定、重复性好的奶牛安氏隐孢子虫的巢氏PCR检测方法,本试验根据GenBank中安氏隐孢子虫18S rRNA和囊壁蛋白(COWP)基因序列设计2对引物,并通过程序优化建立了安氏隐孢子虫巢氏PCR检测方法。结果显示,18S rRNA和COWP巢氏PCR分别扩增出407 bp和430 bp的安氏隐孢子虫特异性基因片段,与预期相符,且扩增出的基因片段与已知基因序列(KX926454)同源性为100%;将阳性样本倍比稀释后进行18S rRNA和COWP巢氏PCR,最低检测量分别为24.3 pg/μL和243 pg/μL,扩增结果与目的片段大小一致,重复性良好,与大肠埃希菌、牛艾美尔球虫、弓形虫均无交叉反应;从华中地区采集的563份样品中,18S rRNA巢氏PCR检测出安氏隐孢子虫阳性185份,而COWP巢氏PCR仅检测出其中的148份;基于18S rRNA巢氏PCR,安氏隐孢子虫阳性率在秋季最高(36.71%),在冬季最低(16.25%),具有显著的统计学差异(P<0.01)。因此,本试验所建立的18S rRNA巢氏PCR和COWP巢氏PCR可为奶牛场安氏隐孢子虫的检测和防控提供有力的技术支持。