摘要：依据GenBank中登录的坏死梭杆菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因序列,设计1对引物进行PCR扩增OMP片段并克隆至pET-28a中,构建原核表达重组质粒pET-28a-OMP。将pET-28a-OMP转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,表达含2个His的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,该重组蛋白分子质量为93ku,为包涵体表达,具有反应原性。本试验结果为坏死梭杆菌OMP免疫机制的研究提供了基础数据。

摘要：为了揭示坏死梭杆菌(***)120ku血凝素相关外膜蛋白的免疫原性,根据***120ku血凝素相关外膜蛋白基因的抗原表位分布情况设计特异性引物,扩增出3个彼此重叠、覆盖整个开放阅读框的基因片段p1、p2、p3,分别构建重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3,在大肠杆菌中进行诱导表达,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting分析重组蛋白的表达情况和反应原性;以纯化的重组蛋白为抗原免疫试验兔,分析重组蛋白的免疫原性。结果显示,重组蛋白P1、P2、P3在大肠杆菌中均得到表达,分子质量分别约为48、59、62ku,能与***阳性的小鼠血清反应,可以刺激试验兔产生特异性抗体,说明***120ku血凝素相关外膜蛋白具有良好的免疫原性,为***基因工程亚单位疫苗的研制提供参考依据。

摘要：以牛源坏死梭杆菌FNn株为试材,根据GenBank上已发表的坏死梭杆菌AF312861标准菌株的lktA序列设计1对引物,利用PCR技术扩增出1 131 bp的坏死梭杆菌白细胞毒素BSBSE基因。将PCR产物插入pGEM-T Easy vector中,经双酶切鉴定正确后进行序列测定。分析表明该BSBSE序列与GenBank上已发表的坏死梭杆菌AF312861标准菌株的lktA序列的核苷酸同源性为99%,推导出的氨基酸序列同源性为98%。为研究BSBSE的免疫原性,构建了原核表达载体pMAL-p2X-BSBSE,用IPTG诱导在大肠杆菌中表达。结果表明,BSBSE基因在大肠杆菌中进行了高效特异性融合表达,融合蛋白分子量约为84.5×103,其中41.5×103为BS-BSE基因表达的蛋白质,43.0×103为MBP融合标签,Western-blotting检测表明该表达产物有免疫原性。

摘要：试验旨在筛选坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum,Fn)外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)中的候选抗原蛋白,为Fn的亚单位疫苗研究奠定基础。采用Uniprot对Fn Omp序列进行预测,基于预测结果筛选拟表达蛋白,并根据GenBank中登录的Fn Omp相应基因序列设计特异性引物,以QL03株为模板进行PCR扩增、原核表达,以及SDS-PAGE和Western blotting分析,并通过血清杀菌试验和小鼠免疫攻毒保护试验,鉴定重组蛋白的免疫原性,筛选最佳候选蛋白。结果显示,预测得到121个蛋白,顺次命名为1-Fn～121-Fn,根据预测结果筛选出8-Fn、11-Fn、41-Fn、95-Fn和102-Fn 5个候选蛋白,其PCR扩增产物大小分别为672、1 164、570、1 059、729bp。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,除8-Fn未表达外,其余4个蛋白均成功表达,大小分别为60、39、59、44ku,命名为P11-Fn、P41-Fn、P95-Fn和P102-Fn,均能与Fn阳性血清反应。血清杀菌试验结果显示,4个重组蛋白均有一定杀菌效果,其中抗P102-Fn血清的杀菌效果最佳,杀菌率可达40.49%。小鼠免疫保护试验结果显示,P11-Fn、P41-Fn、P95-Fn和P102-Fn对小鼠均具有一定的保护效果,其中P102-Fn保护效率最高,达60%。结果表明,P11-Fn、P41-Fn、P95-Fn和P102-Fn均具有良好的免疫原性,其中P102-Fn的免疫原性及诱导机体产生保护免疫反应能力最佳,最有望成为Fn亚单位疫苗的候选蛋白。

摘要：参考羊腐蹄病坏死梭杆菌白细胞毒素蛋白的抗原表位基因序列,利用DNAStar软件预测了牛腐蹄病坏死梭杆菌白细胞毒素蛋白的5个抗原表位区,设计5对在上游和下游含有特异性限制性内切酶的引物,以牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素基因阳性质粒pMD18-T-lkrA为模板,PCR扩增了预测的5个抗原表位区基因,分别命名为PL1、PL2、PL3、PL4和PL5,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6p-1和pPROEX HTa后转化*** BL21(DE3),37℃条件下,用IPTG诱导表达,结果PL1、PL2、PL4和PL5在pGEX-6p-1中获得了表达,而PL3在pPROEX HTa中获得了表达。Westem blot试验结果表明,牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素蛋白5个抗原表位区的重组蛋白PL1、PL2、PL3、PL4和PL5均与坏死梭杆菌多克隆血清反应。

摘要：试验根据坏死梭杆菌白细胞毒素基因序列的特异性,设计1对引物FLP并建立了PCR检测方法。试验结果表明,引物FLP具有相对较高的特异性和敏感性,其敏感性达到了48.5pg。对现地采集奶牛蹄部病料进行PCR检测,发现引物FLP具有很好的特异性,能够准确诊断出坏死梭杆菌的存在。

摘要：基于已发表的坏死梭杆菌白细胞毒素启动子区序列,设计3条特异性引物L7、L8和L9。L7和L8分别与Fnn和Fnf的特异性序列结合,L9与两个亚种序列相匹配。分别扩增出1 076bp和809bp的特异性片段。试验结果表明,这些引物具有高度的特异性和敏感性,能够检测坏死梭杆菌基因组DNA的最小量为10pg/μL,建立的双重PCR体系可用于区分坏死梭杆菌亚种。