摘要：目的:运用DNA条形码技术确定广州市售花胶的物种来源。方法:用自行设计的COⅠ引物对11份市售花胶样品进行PCR扩增、测序,将所得序列构建UPGMA系统发育树,进行聚类分析;用BOLD(The Barcode of Life Data Systems)系统的物种鉴定引擎,与数据库中已有鱼类序列进行比对,鉴定出各样品的基原。结果:11份市售花胶样品用自行设计的引物均可实现扩增,条带清晰、稳定,扩增和测序成功率均为100%;BOLD鉴定结果显示,11份样品来源于3科5种鱼类,UPGMA聚类分析对结果进行了确证。结论:DNA条形码技术与BOLD鉴定系统相结合,可对市售花胶进行准确的基原鉴定。

摘要：随着分子生药学的发展,DNA分子标记在中药基原鉴定中的优势日益显著。为了弥补现有标记在中药质量监管中应用的局限性,该团队自主设计了一种新型分子标记,命名为DNA特征序列(DSS),该标记是仅出现在某个特定分类单元的DNA序列,长度40 bp,鉴定准确率高。该文旨在筛选并验证可准确鉴别《中国药典》一部中收录的植物类药材DSS标记,建立标准核酸序列研制的操作规程,为聚合酶链式反应法在中药质量监管中的广泛应用奠定基础。首先使用植物叶绿体基因组数据库(CGIR)获取待测样品、同属近缘物种及通用背景物种的叶绿体基因组序列,利用IdenDSS软件获得待测物种DSS序列组及其特异性引物对,通过DNA提取、PCR扩增、测序、序列比对进行验证,共获得203种药材的DSS序列。将上述序列上传至中药分子鉴定平台(***)标准数据库中,建立了用于大宗药材鉴定的标准DSS序列存储库,为中药质量监管提供重要的工具。在此基础上,形成DSS标准核酸序列研制操作规程,为进一步以更多元化的基因组序列为基础进行DSS筛选与应用奠定基础。

摘要：建立正品水蛭(宽体金线蛭、日本医蛭)的DNA分子鉴别方法。基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列,分别设计了针对宽体金线蛭和日本医蛭的特异性引物,将其应用于水蛭药材正品、常见伪品菲牛蛭以及含水蛭的中成药脑心通胶囊的PCR技术检测。结果显示单独使用引物WF1R2或WF2R2均可以特异性扩增宽体金线蛭的DNA,产生大小为200 bp左右的条带;而引物HF1R2则可以特异性扩增日本医蛭,产生大小为142 bp的条带;这3对引物在伪品菲牛蛭中均无扩增条带。且用引物WF1R2和WF2R2均在脑心通胶囊中检测到宽体金线蛭,与胶囊所用投料药材一致。结果表明这3对引物可以分别对宽体金线蛭和日本医蛭进行特异性鉴别,且无需测序;而引物WF1R2和WF2R2可直接用于脑心通胶囊中所用水蛭正品的检控。该DNA分子鉴定方法简便、准确,特异性强且灵敏度高,可作为对传统基原鉴定方法的补充,进一步提高水蛭药材及含水蛭的中成药脑心通胶囊的质量控制水平。

摘要：大黄是我国常用大宗药材之一,其基原植物为唐古特大黄、药用大黄和掌叶大黄。不同基原的大黄药材活性成分和药效存在差异,为快速准确鉴定大黄药材3个基原物种,本文利用Illumina高通量测序技术对大黄药材基原物种叶绿体基因组进行测序,完成其组装注释与结构特征解析,并基于叶绿体基因组高变区开发精准鉴别大黄药材3个基原物种的特异DNA条形码,最后进行验证。结果如下:唐古特大黄、药用大黄和掌叶大黄叶绿体基因组全长分别为161039 bp、161093 bp和161136 bp,呈典型四分体结构,均编码131个基因,包括86个蛋白质编码基因、37个tRNA基因和8个rRNA基因。基于高变区设计的5对引物均可对42份样品有效扩增,测序结果分析证明rps16-trnQ、psaA-ycf3、psbE-petL、ndhF-rpl32与trnT-trnL均可作为特异DNA条形码准确鉴定唐古特大黄、药用大黄和掌叶大黄。本文可为大黄药材3个基原物种分类鉴定、保证大黄药材临床用药安全及规范大黄药材市场提供依据。

摘要：目的 建立聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction,PCR)对中药水蛭进行快速种间鉴别。方法 根据中国药典项下3种水蛭(宽体金线蛭、日本医蛭及尖细金线蛭)CO1序列的差异设计并合成3对种属特异性引物,对其进行PCR反应条件优化;对不同批次的水蛭进行稳定性试验,并对同批次的水蛭进行灵敏度试验;利用优化的PCR条件对水蛭混合样品进行分析。结果 3对引物分别能在60,61,59℃的退火温度下扩增出1 000~2 000,1 000~2 000,3 000 bp左右的明亮条带,检测限分别为0.1,1,10 ng,并能够准确鉴别以不同比例混合的水蛭样品。结论 所设计的3对引物可以快速鉴别中药水蛭、常见伪品及混掺水蛭,并具有较高的种间特异性及良好的种内稳定性和灵敏度,可作为中药水蛭传统基原鉴别方法的补充,为其质量控制提供更多参考。

摘要：茵陈来源于菊科植物滨蒿Artemisia scoparia或茵陈蒿***。为了科学准确地鉴定批量茵陈样品的基原及混伪情况,该研究采用了一种基于多种分子标记联合应用的综合方法。研究基于GenBank上茵陈蒿、滨蒿及其他常见蒿属植物的ITS2序列,使用MEGA软件构建系统发育树,评估ITS2序列鉴定效果,并通过组装茵陈蒿的叶绿体基因组,与已发表的茵陈蒿和滨蒿的叶绿体基因组进行比对,开发DNA微条形码(mini-barcode)。将ITS2序列与所得mini-barcode联用进行Sanger测序鉴定单株茵陈样品,结合DNA宏条形码技术鉴定批量茵陈样品。研究结果表明,ITS2序列能够区分中药茵陈与其他易混伪的同属物种,但无法区分茵陈蒿与滨蒿。基于叶绿体基因组的比对结果,选择rpoA—rps11区域作为mini-barcode的开发区域,并设计了能够准确区分茵陈蒿与滨蒿的特异性引物。最终,不同产地的单株代表性茵陈样品及批量茵陈样品的鉴定结果均为茵陈蒿。通过该研究所建立的ITS2与mini-barcode联合鉴定方法,为不同产地批量茵陈的准确鉴定提供了科学依据,为稳定的药材供应提供了支持。

摘要：目的建立一种宽体金线蛭的聚合酶链式反应鉴别方法,实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别。方法以细胞色素c氧化酶亚基I序列为基础,通过分析宽体金线蛭单核苷酸多态性位点,设计宽体金线蛭的特异性鉴别引物。对引物稳定性、引物特异性及灵敏度进行考察确认,同时将其应用于含水蛭的中成药中进行验证。结果使用宽体金线蛭特异性引物KT1-3或KT1-4均可特异性扩增宽体金线蛭的DNA,产物大小分别为235 bp和266 bp,而在其他非宽体金线蛭样品中无扩增条带。该方法对宽体金线蛭DNA的最低检测限为0.01 ng。使用该特异性引物对可在脑血栓片模拟制剂和部分市售脑血栓片中检测到宽体金线蛭。结论建立的DNA分子鉴定方法中宽体金线蛭引物对特异性强、灵敏度高,可作为水蛭药材传统基原鉴定方法的补充,为宽体金线蛭的快速鉴别提供支持。

摘要：目的建立正品全蝎(东亚钳蝎)的特异性DNA分子鉴别方法。方法采用DNA条形码技术,基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列,设计全蝎的特异性引物,对全蝎药材及含全蝎的中成药脑心通胶囊进行PCR扩增及测序,将获得的序列在GenBank数据库中应用BLAST进行结果判定,结果中相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种。结果引物SF1R1和SF2R4均可特异性扩增东亚钳蝎的DNA,产生大小为250~260 bp的条带;且应用这两对引物均在脑心通胶囊中检测到东亚钳蝎,与胶囊所用投料药材一致。结论基于COⅠ序列的DNA条形码技术可用于全蝎药材及脑心通胶囊中全蝎的鉴定,该方法准确、简便、具有高特异性和灵敏度,具有实际应用价值。

摘要：【目的】筛选出对广地龙具有特异性鉴别意义的PCR引物,建立一种快速、准确鉴别广地龙基原真实性的方法。【方法】收集药典收载的4种地龙原动物以及市场常见地龙混淆品6种,从Gen Bank数据库中下载有关蚯蚓的12Sr RNA基因序列,采用通用引物对10种样本PCR扩增后进行测序,依其序列间差异设计3对非保守区特异性引物,筛选对广地龙具有特异性扩增的引物。【结果】引物12St/12Sf对广地龙产生特异性扩增,当退火温度提升至64℃时,其反应表现出高度特异性,仅广地龙具有良好的单一扩增带,而其他样品在同样的条件下无扩增带。所得特异性引物在15种市售广地龙药材中验证结果良好,与传统形态学鉴定结果基本一致。【结论】引物12St/12Sf可作为广地龙物种鉴定的特异性标记物,可以实现广地龙近缘多个物种快速而又准确的鉴定,且不受实验材料的完整性、加工干燥等因素的影响。