摘要：目的:采用多对型特异性引物,通过巢式PCR检测慢性HBV无症状携带者中的HBV基因型分布情况。方法:根据从前S1基因到S基因中的保守序列设计出10条内外引物,并将其中8条内引物分成2组,分别扩增A,B,C和D,E,F型,根据PCR产物大小判定HBV基因型。用此方法检测北京地区HBV慢性无症状HBV携带者血清。结果:265例慢性无症状HBV携带者中,HBVDNA阳性113例,阳性率42.6%。检测到B,C基因型分别为B基因型29例(25.7%),C基因型80例(70.8%),B基因型和C基因型混合感染4例(3.5%)。不同基因型在不同性别构成比例和HBeAg阳性率的差别无统计学意义。结论:北京地区慢性无症状HBV携带者HBVDNA阳性患者中以B,C型为主,C型占优势,存在少量B和C基因型混合感染。

摘要：目的:本研究以构建存活素-增强型绿色荧光蛋白(Survivin&eGFP)融合基因慢病毒表达载体(p-GC-FU-Survivin)为例来探讨In-Fusion克隆技术在常规载体构建中的应用价值。方法:根据In-Fusion技术原理,克隆引物设计时,在Survivin同源序列的两侧分别引入经AgeI线性化的载体p-GCFU两端各15个碱基,将以此引物扩增的聚合酶链式反应(PCR)产物与线性化p-GCFU用In-Fusion交换酶在室温下作用30min,使Sur-vivin特异性扩增产物两端的序列与线性化载体两端的序列发生同源交换,取2μl交换液进行转化,挑取阳性克隆,进行酶切和测序鉴定。将鉴定正确的阳性克隆瞬时转染293T细胞,观察Survivin&eGFP融合蛋白在293T细胞中的表达。结果:每2μl克隆交换液获得大约103个克隆数,阳性率达90%以上,瞬时转染p-GCFU-Survivin可获得Survivin&eGFP融合蛋白在293T细胞中的表达。结论:该技术是一种非连接酶依赖性克隆技术,使基因克隆步骤简化并大大节省了实验时间和经费。

摘要：目的:研究人CYP3A4与POR和cyt b5用悬浮细胞共表达时的最佳条件。方法:悬浮培养Sf 9细胞,分别摸索摇床的温度、转速、摇瓶中细胞液的量、表面活性剂的加量、细胞的培养时间,以及3种病毒的加量比例等条件,并进行优化;然后,将表达产物制成微粒体后用于睾酮的代谢,并分别测其代谢活性。结果:当恒温摇床的温度为27℃,转速为90 r/min,每250 ml摇瓶中加入80～120 ml细胞密度为5×105个/ml的细胞液,并加入0.1%的PluronicF-68,细胞培养72 h时,最适合细胞的生长和目的蛋白的表达。此时,当3种病毒的加量比例为1∶1∶1时,表达条件最佳,其对底物睾酮代谢的Km值、Vmax和CLint分别为119.6μmol/L、0.52μmol/(min.g蛋白)和4.34 ml/(min.g蛋白)。结论:通过三重共表达CYP3A4、POR、cyt b5,以及对表达条件的优化,提高了目的蛋白的表达量,得到了较高代谢活性的CYP3A4,从而为新药代谢及药物-药物相互作用研究奠定了基础,为药物代谢酶的大量表达提供了可行的方案。

摘要：目的建立高致病性禽流感H7和H9亚型荧光定量PCR方法。方法根据禽流感病毒(avian influenzavirus,AIV)HA-H7基因和HA-H9基因分别设计特异AIV H7和H9亚型特异荧光定量PCR引物和探针,优化反应体系和反应条件,分析该试剂的敏感性、特异性、重复性等。结果经优化反应体系和反应条件后,AIV H7试剂和AIV H9试剂的敏感性达到1×104.67EID50和1×103.80EID50水平,特异性与细胞培养敏感性类似;批内和批间精密度Ct值的CV值均远小于10%,可重复性良好。结论本项目研制的AIV H7和H9亚型的敏感性、特异性、重复性均好,适合在禽流感H7和H9亚型疫情和人类疑似禽流感病例中检测使用。

摘要：RNA干扰(RNA interfering,RNAi)是由Fire等人在1998年从线虫的研究中发现RNA沉默(RNA silencing)而提出的[1].RNA沉默是指一种普遍存在于植物、真菌及部分动物中的具序列特异性的基因沉默(gene silence)现象.后来的研究发现,这种的沉默现象主要是由一种双链RNA(double strand RNA,dsRNA)在一种称为Dicer酶的作用下结合到与该dsRNA具有同源性的mRNA上,而把mRNA剪切降解导致该mRNA不能翻译成相应的蛋白质而出现基因沉默[2].