摘要：1998年,在人类口腔鳞癌细胞株UMSCC-22B中首次发现了GPRC5A(Gprotein-coupled receptor family C,member 5,group A)基因。后续的研究提示,GPRC5A是肺癌特异的抑癌基因,与长期慢性感染和吸烟等因素密切相关;而在乳腺癌和胃癌中,GPRC5A又作为癌基因促进肿瘤细胞增殖。GPRC5A受维甲酸、p53和环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的调节,并活化非经典Wnt信号通路,抑制信号转导及转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)信号通路。本综述重点阐述了GPRC5A的生物学特性,与肺癌、乳腺癌和胃癌发生的关系,及其潜在的信号调控通路,以期为肺癌、乳腺癌及胃癌的预防和靶向治疗提供新的思路。

摘要：目的：建立整合素相关激酶（ ILK）基因敲降和黑色素瘤分化相关基因（ mda7）过表达慢病毒包装表达系统。方法：针对人ILK基因序列，设计基因敲降靶点序列（A、B、C），通过限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接，将ILK插入慢病毒载体pSicoR-eGFP，构建siILK-pSicoR-eGFP重组质粒；根据人mda7基因序列，设计引物扩增mda7全长，并插入慢病毒载体pLVX-Puro，构建mda7-pLVX-Puro重组质粒。经双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染人胚肾细胞系293 T细胞，进行慢病毒包装并测定病毒滴度、观察感染效率。各组病毒载体转染PC-3细胞后，用定量PCR和蛋白质印迹法检测ILK基因和mda7 mRNA转录水平及蛋白表达水平。通过MTT法和Transwell实验考察ILK和mda7对PC-3细胞增殖和迁移的影响。结果：成功构建ILK基因敲降及mda7过表达的慢病毒载体，四质粒系统共转染293 T细胞后可见大量绿色荧光染色阳性细胞。浓缩病毒后293 T细胞的感染效率在90％以上，并能高效率感染PC-3前列腺癌细胞。 ILK-A-pSicoR-eGFP和ILK-B-pSicoR-eGFP组ILK干扰效果最佳（P＜0．05），mda7的表达水平远高于对照组（P＜0．05），且持续稳定表达至少1个月。 ILK和mda7对PC-3细胞的增殖在96 h内有明显抑制作用，并对其迁移亦有显著抑制（均P＜0．05）。结论：成功构建并鉴定人ILK 基因敲降和mda7过表达慢病毒载体，可为探讨ILK和mda7基因在肿瘤细胞中的生物学功能提供良好工具，也为探索安全、高效的肿瘤治疗途径奠定实验基础。

摘要：目的通过观察pGenesil-1／肿瘤转移相关基因1（MTA1）对人乳腺癌细胞株MDA—MB1231和MCF-7细胞MTA1基因的沉默效应，了解其对ERα表达及浸润能力的影响。方法设计合成并构建重组质粒pGenesil-1／MTA1，将该质粒分别转染MDA—MB-231和MCF-7细胞，荧光显微镜评估转染效率，RT—PCR检测MTA1和基质金属蛋白酶（MMP）-9 mRNA表达，免疫细胞化学检测ERa和MMP-9表达，Western blot检测ERα蛋白表达，用Boyden小室体外侵袭实验检测转染前后两株细胞侵袭力的变化。结果成功构建重组质粒pGenesil-1／MTA1，并成功转染入MDA—MB-231和MCF-7细胞（平均转染效率分别为82.5％和78.2％）。两株细胞MTA1 mRNA表达均受到不同程度的抑制（分别为80.2％和58.7％）。经干扰MTA1基因后MDA-MB-231细胞ERα蛋白表达得到逆转，呈阳性表达；MMP-9 mRNA表达下降；细胞体外侵袭力减弱（侵袭指数为27．2％±2.1％），与干扰前（76.3％±2.4％）相比差异有统计学意义（P〈0．05）。而MCF-7细胞转染重组质粒并干扰MTA1基因后，ERα蛋白、MMP-9 mRNA表达和体外侵袭能力变化均无统计学意义（P〉0.05）。结论重组质粒pGenesil-1／MTA1能有效抑制人乳腺癌细胞株MDA—MB-231和MCF-7细胞MTA1基因表达，ERα在MDA—MB-231细胞得到逆转，表达阳性，其高侵袭能力减弱，使干扰肿瘤转移靶基因成为可能。

摘要：目的:在肿瘤抑制基因PTEN缺失的小鼠胚胎成纤维细胞Pten-/-MEF241细胞中,研究多效生长因子(p le iotroph in,Ptn)对细胞增殖的影响。方法:设计并合成可编码针对小鼠Ptn基因的小干扰RNA(siRNA)寡核苷酸,构建至pS ilencerTM3.1-H1载体,将载体转染进Pten-/-MEF241细胞中,获得稳定表达细胞克隆株,通过Northern印迹检测Ptn基因表达被抑制的情况,根据细胞生长曲线检测沉默Ptn基因对Pten-/-MEF241细胞生长的影响。结果:获得的稳定克隆株中,与对照细胞相比,Ptn基因的表达在转染Ptn siRNA-B的3株细胞中均得到了有效的抑制,而在转染Ptn siRNA-C的2株细胞中抑制效果较差。生长曲线结果显示,在Pten-/-MEF241细胞中,沉默Ptn基因能够减缓Pten-/-MEF241细胞的生长速度。结论:本研究获得了可有效抑制Ptn基因的小干扰RNA,证明沉默Ptn基因可抑制PTEN基因缺失细胞的增殖,提示Ptn可作为治疗具有PTEN基因突变的肿瘤的药物靶标。

摘要：目的 建立一种包含甲基化标准品的新型高通量肺癌相关基因的甲基化检测系统.方法 2009年3-6月上海交通大学医学院附属胸科医院经病理学和影像学确认的非小细胞肺癌患者8例,其中男7例,女1例,平均年龄（57±11）岁,手术后留取肺癌组织及外周血.男性健康志愿者1名,年龄35岁,抽取外周血20 ml,用以分离单个核细胞提取DNA制备质粒.对7个肺癌相关基因的启动区进行克隆,用各基因的特异性引物对克隆到质粒中的各基因片段再次进行扩增,PCR产物用甲基化酶*** Ⅰ和亚硫酸盐处理.通过设计3＇末端CpGpCpG探针来识别甲基化模板,并经最佳连接酶、最佳退火温度及连接温度的选择,建立一套多重连接PCR体系,最后运用液相芯片平台对扩增的标准品和临床标本进行检测.利用甲基化特异性PCR检测新系统的可靠性.结果 成功的构建了7个基因的甲基化和非甲基化标准品,并建立了多重PCR偶联液相芯片的快速检测系统,p16INK4A、APC、DAPK、RARβ、RASSF1 A、MGMT和GSTP1甲基化标准品的荧光信号值分别为863、909、703、701、901、1 060和885,与非甲基化标准品区分明显.抽提8例患者的肺癌组织DNA,对其中检测出阳性频率较高的基因进行甲基化特异性PCR,产物电泳结果 与新建甲基化检测系统检测结果 完全一致.结论 本研究建立的新型检测系统能同时准确地检测7个基因甲基化状态,有望应用于临床标本的检测.

摘要：目的构建针对鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）EB病毒（Epstein—Barr virus，EBV）潜伏膜蛋白1（latent membrane protein1，LMP-1）的特异性发夹状RNA（small hairpin RNA，shRNA）干扰序列的重组腺相关病毒（recombinant adeno—associated virus，rAAV）载体（rAAV-shRNA—LMP-1），介导其体外表达并鉴定其生物活性。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性shRNA干扰序列，采用分子克隆的方法，将干扰序列及U6启动子插入pAAV-2质粒中，采用无需包装辅助病毒的双质粒共转染方法制备rAAV-shRNA-LMP-1，测定其滴度及感染效率，RT-PCR鉴定目的基因的抑制效率。结果以rAAV-EGFP5×10^4v．g（virus genome，病毒基因组数）／细胞转染C666-1细胞，转染效率大干95％，PT—PCR鉴定rAAV-shRNA-LMP-1以5×10^4v．g／细胞转染C666—1后目的基因抑制效率大于90％。结论通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达，为进-步研究肿瘤基因治疗，尤其是动物实验奠定了基础。

摘要：目的构建抑癌基因人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)及其突变体(F341V)的真核表达载体,检测其在乳腺癌细胞系MCF-7中的表达,观察PTEN及其突变体(F341V)基因对MCF-7细胞增殖及凋亡的影响。方法设计PTEN基因引物,PCR扩增PTEN及其突变体(F341V)编码基因,构建p CMV-Myc重组载体,转染MCF-7细胞系,Western blot检测其表达,酶标仪及流式细胞术检测细胞的增殖及凋亡。结果 PTEN及其突变体(F341V)真核表达载体构建成功,且在MCF-7细胞中成功表达。转染PTEN基因的MCF-7细胞生长速度比对照组MCF-7细胞减慢,转染PTEN(F341V)基因的MCF-7细胞恢复了快速的生长速度;相反的,转染PTEN基因的MCF-7细胞凋亡率增加,转染PTEN(F341V)基因的MCF-7细胞凋亡率相比PTEN基因明显降低。结论 PTEN及其突变体真核表达载体成功转染入MCF-7细胞系中,且显著影响其增殖及凋亡。

摘要：目的构建乳腺癌转移抑制基因（BRMS1）的真核表达载体pcDNA3．1（-）B／myc-BRMSI，为进一步研究恶性肿瘤的转移机制及基因治疗提供物质基础。方法常规方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7，Trizd法提取细胞株总RNA；设计一对特异性引物，经过逆转录反应获得BIIMS1 cDNA的CDS序列，连接到质粒pcDNA3．1／mye—His（-）B上，构建BRMS1的真核表达载体peDNA3．1（-）B／***1，行基因测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK-293，行Westernblot验证其是否表达。结果重组质粒pcDNA3．1（-）B／myc-BRMS1经双酶切及基因测序分析，验证了克隆的人BRMS1基因cDNA序列与GenBank[AF159141]公布的人BRMS1基因的cDNA序列吻合，重组体peDNA3．1（-）B／myc—BRMS1中插入的目的基因BRMS1是正向、单倍插入。结论成功构建了BRMS1真核表达载体pcDNA3．1（-）B／myc—BRMS1，为深入研究BRMS1基因功能和BRMS1基因治疗奠定了物质基础。

摘要：目的:研究肿瘤相关基因p27、p21在结肠癌组织及其转移灶中的表达及其与患者预后的关系。方法:收集随访资料完整并同时具有淋巴结转移的结肠癌标本100例,按预先设计的需要制作成组织芯片,进行p27、p21免疫组化染色。根据染色指数(stainingindex,阳性细胞百分数×染色强度)观察分析结肠癌原发灶与转移灶的关系,并行相关分析。结果:100例结肠癌标本中,转移灶组织中p27、p21的表达均高于原发灶肿瘤组织的表达,差别均具有统计学意义(P<0.01)。p27、p21的表达与患者的预后呈负相关。结论:肿瘤相关基因p27、p21在已转移的结肠癌组织中的高表达和表达转移可能预示患者预后更差。

摘要：目的制备鼠源性GDDR单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法利用SEAL对GDDR氨基酸序列表位行参数评分,结合人、鼠蛋白序列同源性,设计并合成重组GDDR蛋白,并以所获得蛋白免疫BALB/c小鼠制备鼠单克隆抗体,运用ELISA法检测抗体效价,免疫印迹分析和免疫组织化学鉴定抗体特异性。结果经常规细胞融合和筛选获得两株稳定分泌抗GDDR抗体骨髓瘤细胞株,ELISA检测腹水效价达1100000,Western-blot证实抗体可以和GDDR蛋白特异性结合,免疫组织化学结果显示正常胃黏膜组织GDDR表达明显高于胃癌组织。结论成功制备出两株抗GDDR单克隆抗体mAb,为进一步研究GDDR的生物学功能提供良好的工具。