摘要：目的探讨 mdr1短发夹 RNA(mdr1 shRNA)对人红白血病耐阿霉素细胞系 K562/ADM的耐药逆转作用。方法编码设计合成靶位 mdr1基因 mRNA 具有19个碱基发夹结构互补的寡核苷酸模板,构建2个 shRNA 表达载体 pSilencer^(TM)3.1-H1 neo mdr1-A和 mdr1-B,将其稳定转染 K562/ADM细胞。用 RT-PCR 法检测转染后 K562/ADM 细胞 mdr1 mRNA 表达,Western blot 检测 P-糖蛋白(P-gp)表达,流式细胞术和 MTT 法分别检测 K562/ADM 细胞凋亡和对阿霉素的敏感性,用激光共聚焦荧光显微镜观察并测定细胞内柔红霉素的积累。结果在 pSilencer^(TM)3.1-H11 neo mdr1-A 和 mdr1-B shRNA表达载体稳定转染的 K562/ADM 细胞,mdr1 mRNA 表达分别减少到转染前的35.9%(P<0.05)和27.5%(P<0.01);同时 Western blot 结果显示 P-gp 表达被明显而特异地抑制,对阿霉素的耐药性由79倍分别减低到38倍和30倍;并且,细胞内荧光强度与对照组相比显著增加(P<0.05),与阿霉素联合应用凋亡细胞百分率分别增加至18.1%(P<0.05)和54.4%(P<0.01)。结论靶向 mdr1基因shRNA 表达载体可有效逆转耐药,使耐药的肿瘤细胞恢复对化疗药物的敏感性。

摘要：目的:构建针对多药耐药基因(mdr1)的RNA干扰(RNAi)表达克隆质粒。方法:采用Invitrogen公司的Block-i TTMU6RNAi Entry Vector Kit和BLOCK-i T Lentiviral RNAi Expres-sion System生产表达克隆质粒。针对mdr1人工设计合成一段寡核苷酸,依照试剂盒说明书分别构建mdr1entryclone质粒和表达克隆质粒。以mdr1entry clone质粒瞬时转染MCF-7/ADM细胞株,MTT法测细胞对ADM的耐药性及流式细胞仪测试P-gp表达情况。抗生素筛选表达克隆、抽提质粒电泳鉴定。结果:测序证实mdr1entry clone质粒构建正确,无任何突变.转对照质粒组和转mdr1entry clone质粒组,P-gp表达水平分别为(31.97±1.2)%和(7.88±0.5)%,IC50分别为1.27和0.4μg/mL。两组比较,P-gp表达和IC50差异均有统计学意义,P均<0.05。抗生素筛选显示转化克隆对氯霉素敏感、对氨苄青霉素具抗性,抽提质粒琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒大小符合设计要求。结论:mdr1entry clone质粒和表达克隆质粒构建正确,为进一步阻断mdr1基因表达逆转肿瘤多药耐药奠定了基础。