摘要：为了探寻天然原肌球蛋白的可替代物作为诊断和治疗虾类过敏的基础材料,本研究从河虾中提取总RNA,利用cDNA末端快速扩增技术克隆河虾过敏原原肌球蛋白基因的全长序列。以此序列设计表达引物,构建表达载体,最后通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组原肌球蛋白。结果显示,河虾的原肌球蛋白基因cDNA序列全长1658 bp,开放阅读框855 bp,编码284个氨基酸,预测蛋白等电点4.70,预测分子质量32.8 kDa。河虾原肌球蛋白cDNA序列已上传至GenBank数据库,登录号为OP974621。本研究成功构建河虾原肌球蛋白重组表达质粒pET-30a-TM,并用IPTG进行体外诱导表达,最佳诱导条件为IPTG浓度1 mmol/L、37℃诱导4 h。可溶性分析结果表明重组原肌球蛋白主要以可溶性形式存在于细胞破碎液的上清液中,分子质量约38 kDa。

摘要：本研究克隆了驴脂肪酸去饱和酶2(FADS2)基因并进行了生物信息学分析,检测了其在驴不同组织中的表达。通过设计FADS2基因引物,PCR克隆得到其CDS序列,然后对FADS2基因编码产物进行生物信息学预测,同时使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测驴心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪、乳腺内FADS2基因相对表达量。结果显示:驴FADS2基因CDS长1335 bp,可编码444个氨基酸,FADS2蛋白分子质量为52.43 ku,等电点为8.29,不稳定指数为37.22,疏水性总平均值为-0.231,属于稳定碱性亲水蛋白;FADS2蛋白二级结构主要由α-螺旋(51.80%)和无规则卷曲(37.61%)构成。FADS2基因在所检测驴组织中均有表达,其中在脂肪和乳腺中相对表达量最高,其次为脾脏、肺脏、肾脏、心脏和肝脏,肌肉中相对表达量最低。结果提示,FADS2可能在驴脂肪和乳腺等组织不饱和脂肪酸的合成过程中发挥重要作用。本研究可为进一步探究驴脂肪和驴乳中高不饱和脂肪酸的合成机理提供基础。

摘要：旨在克隆驴硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-CoA desaturase-1,SCD1)基因并进行生物信息学分析、检测其在驴不同组织中的表达。设计SCD1基因引物,PCR克隆得到其CDS序列,然后对SCD1基因编码产物进行生物信息学预测,同时使用qRT-PCR检测驴心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、乳腺内SCD1基因mRNA相对表达量。结果显示,驴SCD1基因CDS长1080 bp,可编码359个氨基酸,SCD1蛋白质分子质量为41.61 ku,等电点为9.32,不稳定指数为44.16,疏水性总平均值为-0.157,属于不稳定碱性亲水蛋白;SCD1蛋白二级结构主要由α-螺旋(51.25%)和无规则卷曲(42.62%)构成。SCD1基因在所检测驴组织中均有表达,其中在肝脏中表达量最高,脂肪、乳腺和肺脏中次之,心脏和肌肉中最低(P<0.05),提示SCD1在驴肝脏、脂肪和乳腺等组织不饱和脂肪酸的合成过程中发挥重要作用。

摘要：为探究陆川猪骨骼肌生长发育过程中MyoD1基因所起作用,对陆川猪成肌细胞决定基因1(MyoD1)进行克隆,展开生物信息学分析,对其在陆川猪不同组织中的表达进行分析,以NCBI上已公布的野猪MyoD1基因序列为模板,进行特异性引物设计,克隆陆川猪MyoD1基因CDS区,并与NCBI已公布的野猪、牛、绵羊、人、小鼠、大鼠基因序列进行相似性比对,由此构建系统进化树,通过在线软件开展生物信息学分析,而后使用实时荧光定量PCR检测在陆川猪不同组织中MyoD1基因的相对表达量。陆川猪MyoD1基因CDS区全长960 bp,共编码319个氨基酸,碱基突变共存在5处,与野猪、牛、绵羊、人类、小鼠、大鼠的MyoD1基因CDS序列相似性分别为99.2%,93.0%,92.3%,90.0%,84.3%,84.0%,其中与野猪相似性最高,表明二者亲缘关系最为接近;陆川猪MyoD1基因原子总数为4680,蛋白的分子质量为33.99 ku,分子式为C_(1457)H_(2296)N_(442)O_(471)S_(14);不稳定系数为63.87,表明其缺乏稳定性;等电点为5.63,属于酸性蛋白;不存在跨膜结构,存在35处磷酸化位点及1处糖基化位点;蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占比60.69%。陆川猪MyoD1基因在背最长肌中的表达量最高,且显著高于其他组织,表达量最低的组织为肾脏。陆川猪各组织中均有MyoD1基因表达,且主要在背最长肌中表达,由此推测,MyoD1基因在陆川猪肌肉生长发育过程中可能起到至关重要的作用。

摘要：【目的】克隆芦笋(Asparagus officinalis)甾醇糖基转移酶基因AoSGT1,分析其潜在催化活性,为解析芦笋皂苷合成途径及代谢调控机制提供科学依据。【方法】基于芦笋转录组数据设计特异性引物,扩增AoSGT1基因的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),经测序验证获得目标基因序列并进行生物信息学分析;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RTqPCR)测定各组织基因表达量;构建pGEX-4T-3-AoSGT1原核表达载体,并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(De3),随后诱导实现重组蛋白表达。【结果】AoSGT1长1800 bp,编码599个氨基酸,其相对分子质量为66.72 kD,属于亲水性蛋白,无跨膜域和信号肽。系统发育结果表明,AoSGT1与盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)Dz3GT_(2)有较高同源性,同属UGT80B1亚家族。多序列比对揭示了该蛋白序列包含甾醇糖基转移酶保守结构域PSBD Box和PSPG Box,预示其具有对甾体化合物3β-OH位点潜在糖基化活性。RT-qPCR结果显示,AoSGT1在芦笋根中高表达,而在茎和花中低表达。此外,SDS-PAGE结果表明,目标蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,其大小与预测值相符。【结论】成功克隆AoSGT1基因,并确认其在芦笋中呈现组织特异性表达,推测其可能参与芦笋甾体皂苷生物合成。同时,成功在大肠杆菌中实现了目标蛋白的异源表达。

摘要：本研究旨在克隆茶花鸡2号α干扰素基因(IFN-α)CDS区序列并进行生物信息学分析,为后续研究IFN-α基因对茶花鸡2号免疫功能的影响提供参考。以茶花鸡2号为实验对象设计IFN-α引物,提取总RNA,反转录PCR扩增并克隆其编码区序列,进行生物信息学分析。结果显示茶花鸡2号IFN-α基因CDS序列全长582 bp,IFN-α蛋白等电点5.05,平均疏水指数-0.514,为酸性亲水蛋白,且存在信号肽和1个跨膜区,主要定位于细胞核。IFN-α蛋白被4个N糖基化位点、5个O糖基化位点和20个磷酸化位点修饰,主要由α-螺旋与无规卷曲构成。茶花鸡2号与固始鸡、海兰鸡、惠阳胡须鸡、罗曼鸡和乌骨鸡的氨基酸同源性分别为95.9%、97.9%、97.9%、97.9%和95.9%。IFN-α蛋白与IRF7、IFNAR1、IFNAR2和IFNK等蛋白存在互作关系。本研究结果可为进一步探讨IFN-α基因在茶花鸡2号病毒疾病防治中的作用提供理论依据。

摘要：以苦瓜八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因为靶标,构建其特异gRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以期为建立苦瓜CRISPR/Cas9基因编辑技术体系奠定基础。以苦瓜自交系B07叶片cDNA为模板,同源克隆苦瓜McPDS基因CDS序列。结果表明,McPDS基因CDS序列全长1731 bp,编码576个氨基酸,蛋白质相对分子质量为64.44 kD,理论等电点(PI)为7.09。跨膜结构分析结果表明,该蛋白为亲水性非跨膜蛋白。系统进化树分析结果表明,McPDS与黄瓜、甜瓜等葫芦科植物中的PDS蛋白同源性较高。此外,以McPDS为靶标基因,在5’端筛选2个高特异性靶点,经设计引物,成功构建1个双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体,为苦瓜基因编辑体系的建立奠定了技术基础。

摘要：九香虫Aspongopus chinensis Dallas,1851是中国传统药食两用资源昆虫,其需求量日增。然其存在严格的生殖滞育现象,脂肪酸合酶(Fatty Acid Synthase,FASN)与昆虫滞育关系密切。本文根据九香虫转录组数据设计了FASN特异性引物,提取九香虫总RNA,利用PCR技术克隆出九香虫脂肪酸合酶基因(AcFASN),利用生物信息学软件对其进行了生物信息学和同源进化树分析,并通过实时荧光定量试验获取了AcFASN在九香虫中的时序表达图谱。结果显示:九香虫AcFASN基因全长7092 bp,编码2363个氨基酸;九香虫AcFASN是亲水性蛋白质,亚细胞主要定位于细胞质,是一种无信号肽、非跨膜、非分泌型蛋白。同源进化树分析表明,AcFASN氨基酸序列与茶翅蝽Halyomorpha halys的FASN氨基酸序列进化关系较近。时序表达谱显示AcFASN基因在滞育期表达量较高,预示着AcFASN基因极可能通过改变九香虫体内AcFASN的表达量来影响九香虫滞育等生命活动。

摘要：目的:克隆穿心莲转录因子ApbHLH80基因,并对其进行生物信息学分析和表达分析。方法:根据穿心莲转录组数据库设计引物,采用PCR扩增等方法克隆ApbHLH80全长序列,使用生物信息学在线分析工具,分析和预测该基因编码蛋白的理化性质,采用实时荧光定量PCR分析该基因在茉莉酸甲酯处理下的表达模式,并采用高效液相色谱法测定穿心莲内酯含量。结果:生物信息学分析表明,该基因开放阅读框长度包含1 095 bp,共编码364个氨基酸;该基因的氨基酸序列分子量约为39.96 ku,理论等电点为5.73,无信号肽和无跨膜结构,属亲水性核蛋白;该蛋白与苏麻、丹参、一串红和芡欧鼠尾草等物种亲缘关系较为接近,都具有b HLH_AtbHLH_like保守结构域。实时荧光定量PCR分析结果表明,ApbHLH80的表达量在叶片中最高,并且响应茉莉酸甲酯的诱导,其表达模式与穿心莲内酯合成存在密切联系。结论:成功克隆得到的ApbHLH80基因可能参与调控穿心莲内酯合成,为进一步探讨其潜在的调控作用提供理论支撑。

摘要：目的克隆粉防己Stephania tetrandra苄基异喹啉类生物碱生物合成途径中的细胞色素P450基因StCYP80G,进行生物信息学分析、表达载体构建和组织特异性表达分析。方法设计特异性引物,从粉防己cDNA中克隆得到StCYP80G编码蛋白的基因序列;利用生物信息学在线工具预测StCYP80G蛋白的结构域、理化性质和跨膜区等分子特征;利用MEGA11.0对氨基酸进行多序列比对和系统进化关系分析;通过同源重组法构建含有StCYP80G基因的重组质粒;采用实时荧光定量PCR技术分析该基因在粉防己不同组织中的相对表达量。结果StCYP80G基因开放阅读框长度为1458 bp,编码485个氨基酸,蛋白质相对分子质量为54770,预测其具有CYP450的保守结构域,含有跨膜结构域,可能定位在内质网上。氨基酸序列比对与系统进化树分析显示,StCYP80G与莲NnCYP80G、智利桂Ls CYP80G的序列具有同源性且一致度较高,推测StCYP80G与这2条序列具有相似的功能。StCYP80G基因在粉防己叶中表达量显著高于根中。质粒序列分析结果表明,重组质粒pESC-Leu-StCYP80G构建成功。结论StCYP80G基因的克隆、生物信息学分析、重组质粒的构建、以及组织表达特异性的研究结果,为进一步探究其在苄基异喹啉类生物碱生物合成途径中的功能奠定了基础。