摘要：香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)是调节萜类化合物生物合成的关键酶,为了研究GGPPS基因在百合萜类物质合成中的作用,本试验以‘西伯利亚’百合(Lilium‘Siberia’)为试材,克隆了GGPPS大亚基(***)和小亚基(***)基因,并分析其表达和功能。通过生物信息学分析、相对表达量分析、荧光定量PCR、亚细胞定位、基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)预测并验证其特征及功能,揭示其表达模式。结果表明,***和***分别为1 100 bp和1 040 bp, ***和***的氨基酸序列与其他物种的***和***的氨基酸序列具有较高的一致性,系统进化树显示它们分别与薯蓣(Dioscorea cayenensis ***)和深圳拟兰(Apostasia shenzhenica)亲缘关系最近。***和***基因均定位在叶绿体中,表达量随百合的生长发育呈现先上升后下降的趋势。***在花被片中高量表达,***在花药中显著高量表达。VIGS试验显示芳樟醇、罗勒烯、月桂烯释放量下降。***和***基因对百合花香单萜类物质合成具有重要作用,本试验为进一步研究百合GGPPS以及相关代谢途径提供理论基础。

摘要：【目的】克隆钩藤(Uncaria rhynchophylla)中马钱苷酸甲基转移酶(loganic acid methyltransferase,LAMT)基因及其启动子,对UrLAMT基因的组织表达及其对生物和非生物胁迫的响应进行分析,并对UrLAMT及其启动子的生物信息学进行分析,为进一步研究UrLAMT转录调控奠定基础。【方法】基于钩藤的转录组数据设计引物,采用PCR从钩藤cDNA中克隆UrLAMT序列,并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR,分析UrLAMT在钩藤不同组织(根、茎、叶、花、果实、钩)中的表达,以及对外源茉莉酸甲酯(MeJA)、遮光/复光胁迫的响应;利用FPNI-PCR技术克隆UrLAMT上游启动子序列,并验证其活性,结合酵母单杂交试验,分析相应转录因子与UrLAMT启动子的调控关系。【结果】克隆得到钩藤UrLAMT序列,其长度为1137 bp,共编码378个氨基酸。UrLAMT蛋白质相对分子质量为42.64 ku,理论等电点为5.76,为亲水性蛋白,无信号肽,不含跨膜结构,定位在细胞质中;UrLAMT基因在钩藤叶中表达量最高,其次为根;UrLAMT均能响应MeJA和光;其与短小蛇根草和长春花的进化关系较近。UrLAMT启动子序列长度为1141 bp,除核心响应元件外还含有多个光响应元件,UrLAMT启动子在酵母中与光调控转录因子HY5存在相互作用。【结论】获得了UrLAMT基因及其启动子序列,其在钩藤叶中表达量最高,可能受光诱导。

摘要：【目的】克隆华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因PcoPMK的cDNA序列,分析该基因在华中樱‘YS01’不同发育阶段花瓣中的表达情况及其编码蛋白质的结构特征和理化性质,为进一步研究PcoPMK基因在华中樱萜烯类物质合成途径中的功能提供参考。【方法】参照近缘物种的PMK同源基因cDNA保守序列设计特异性引物,应用RT-PCR技术扩增PcoPMK基因的cDNA序列,并进行克隆测序,同时应用定量RT-PCR技术分析该基因在‘YS01’不同发育阶段花瓣中的表达情况。应用ORF Finder在线工具预测基因的开放阅读框及编码的蛋白质序列;分别应用ExPASy、SOPMA、Swiss model和CDD在线工具分析蛋白质的理化性质、二级、三级结构和功能结构域;分别应用DeepTMHMM、SINALP 4.0 Server和PredictProtein在线程序预测蛋白质的跨膜结构、信号肽和亚细胞定位;应用MEGA7.0软件构建基因的系统进化树。【结果】华中樱PcoPMK基因开放阅读框序列大小为1530 bp,编码509个氨基酸,GenBank登录号为OR373074。编码蛋白质的相对分子量为55.199 kD,理论等电点为5.68,属于亲水性的稳定蛋白,定位于细胞质。PcoPMK蛋白与扁桃、烟草和拟南芥等代表性物种PMK同源蛋白的序列相似度较高,含有3个典型且保守的蛋白结构功能域和1个ATP结合位点,无跨膜螺旋和信号肽,属于非分泌蛋白。PcoPMK基因在华中樱‘YS01’盛开期花瓣中的相对表达量显著高于花蕾期和半开期(P<0.05),与同时期花瓣中萜烯类香气物质的含量变化规律一致。【结论】本研究成功克隆了华中樱PcoPMK基因,初步推测其可能在花瓣萜烯类物质合成途径中发挥重要作用,为进一步研究该基因的生物学功能提供了参考。

摘要：花青素赋予植物丰富的颜色。花青素合成酶是花青素合成途径末端的一个重要催化酶。为了研究蓝星睡莲花色形成过程中的关键酶基因NcANS的序列特征、表达规律和启动子结合元件,本研究分别以蓝星睡莲叶片和花瓣为材料,采用PCR和RT-PCR方法分别克隆了NcANS的基因序列和编码区序列,基因序列长度为1 277 bp,两个外显子中间有一个200 bp内含子;编码区序列含完整的开放读码框(ORF),为1 077 bp,编码358个氨基酸,含有DIOX-N和2-酮戊二酸-Fe2+-双加氧酶保守域,后者含有2-酮戊二酸和Fe2+的活性位点。氨基酸序列比对和系统发育分析表明,NcANS与基部被子植物无油樟ANS一致性最高,与同属侏儒卢旺达睡莲亲缘关系最近,与单子叶植物进化关系最远。荧光定量PCR结果表明NcANS的表达量在蓝星睡莲花药中最高,其次是在花瓣S3时期,在花瓣的五个发育时期呈先升高后急剧降低的趋势,在S3时期达到峰值。直接PCR技术分离得到的NcANS启动子序列长度为1 382 bp,其含有MYB、MYC等转录因子结合位点、参与响应厌氧、低温、光、茉莉酸甲酯、生长素、发育或代谢等信号的顺式作用元件。本研究结果为进一步研究NcANS基因功能和蓝星睡莲花色形成分子机理提供理论基础。

摘要：为了研究WRKY33基因在丹参非生物胁迫中的作用机制,以白花丹参为试验材料,对丹参转录组数据进行分析,挖掘出丹参WRKY33基因参考序列并设计特异性引物,利用基因克隆技术从丹参中克隆出WRKY33基因的全长cDNA,命名为SmWRKY33。对SmWRKY33基因进行生物信息学分析,同时利用荧光定量方法探究SmWRKY33基因在逆境胁迫下的表达模式。结果表明,SmWRKY33基因核苷酸长度为1 635 bp,编码544个氨基酸。生物信息学分析显示,SmWRKY33基因的理论相对分子量为60 835.66,等电点为7.00,定位于细胞核,不存在跨膜区及信号肽,SmWRKY33蛋白为不稳定亲水蛋白。亲缘关系显示,SmWRKY33与紫苏、芝麻、白花泡桐的WRKY33亲缘关系较近。密码子偏好性分析得出拟南芥真核表达最适应丹参SmWRKY33基因的外源表达。qRT-PCR结果表明,SmWRKY33基因在低温、高温、PEG、NaCl等逆境胁迫诱导下具有不同的表达模式,其中低温、NaCl能显著诱导SmWRKY33基因的高表达,说明该基因对温度调节、盐胁迫较为敏感,猜测其参与温度、盐胁迫调控反应机制。本试验首次从丹参中克隆出SmWRKY33基因,探讨了该基因在丹参逆境胁迫下的作用机制,旨在为培育丹参的抗逆新品种提供参考基因。

摘要：SOC1/TM3是MADS-box家族一员,它能介导多条开花途径的信号整合,从而调控开花的时间和花器官的发育。为了解SOC1类基因在马尾松生殖生长中的作用,从转录组测序结果中筛选到一条SOC1类同源基因,设计特异性引物,采用c DNA末端快速克隆(RACE)技术,获得该基因的全长cDNA序列为1147 bp,包括666 bp的开放阅读框(ORF),共编码220个氨基酸,命名为PmMADS13。氨基酸序列比对分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端具有高度保守的SOC1 motif基序;进化树分析表明马尾松PmMADS13与油松的DAL9基因、辐射松的MADS9基因、火炬松的MADS13基因的亲缘关系最近,属于SOC1/TM3亚家族;RT-PCR分析显示,PmMADS13在马尾松生殖器官雌花、雄花中均有高表达,其次是茎端和针叶,在根部组织中的表达量最低。推测PmMADS13是参与马尾松成花的重要基因。

摘要：黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是植物花青素(anthocyanin)合成过程中的关键酶。本研究以红色比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)不同发育时期的花瓣为实验材料,利用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术对比利时杜鹃花黄烷酮3-羟化酶(Rhododendron hybridum *** 3-hydroxylase,RhF3H)基因进行克隆,并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR技术对不同发育时期花瓣RhF3H基因表达量进行分析;构建pET-28a-RhF3H原核表达载体对RhF3H蛋白进行制备和纯化;构建pCAMBIA1302-RhF3H过表达载体,通过农杆菌介导法进行拟南芥遗传转化研究。结果表明,比利时杜鹃花RhF3H基因全长为1245 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1092 bp,编码363个氨基酸,含有Fe2+结合基序和2-酮戊二酸结合基序的双加氧酶超家族。系统进化分析表明,比利时杜鹃花RhF3H蛋白与越橘F3H蛋白亲缘关系最近;实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析表明,在不同发育时期花瓣中,红色比利时杜鹃花RhF3H基因的表达水平呈先上升后下降的趋势,在初开期表达量最高;原核表达结果表明,构建原核表达载体pET-28a-RhF3H诱导蛋白大小约为40 kDa,与理论值相近;成功获得转基因RhF3H拟南芥植株,PCR鉴定和β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)染色证明RhF3H基因整合到拟南芥植株基因组中。qRT-PCR、总黄酮和花青素含量分析显示,相对于野生型,RhF3H在转基因拟南芥植株中显著高表达,其总黄酮和花青素含量也显著增加。本研究为探究杜鹃花RhF3H基因功能提供一定的理论基础,对杜鹃花花色的分子机理有重要的研究价值。

摘要：4-羟基-3-甲基-2赤藓磷酸合酶(4-hydroxy-3-methyl-2-butenyl diphosphate synthase, HDS)是单萜合成途径中的关键酶。为揭示其在‘西伯利亚’百合(Lilium ‘Siberia’)萜烯合成中的作用,本文克隆了LiHDS基因,进行生物信息学分析、亚细胞定位和病毒诱导基因沉默(VIGS)功能验证,并采用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)对该基因进行时空表达分析。结果表明, LiHDS基因开放阅读框为2 223 bp,编码蛋白包括740个氨基酸,理论分子量81 967.95,理论等电点为5.76,与小果野蕉(Musa acuminata)等HDS蛋白相似度较高,LiHDS蛋白主要定位在叶绿体。LiHDS在内花被片与外花被片中表达量最高,在根和叶中表达量最低。花被片中LiHDS基因在盛开期表达量最高,衰败期最低。LiHDS基因被沉默后,罗勒烯和芳樟醇释放量显著降低,分别下降79%和73%,说明LiHDS基因在百合单萜合成中起着重要作用。

摘要：花青素还原酶(anthocyanidin reductase,ANR)是黄酮合成途径中的关键酶,该酶的催化活性对花青素含量有重要的调控作用。本研究根据忍冬转录组数据,设计特异性引物,克隆忍冬和红白忍冬ANR基因的CDS、gDNA及启动子序列。结果表明,从忍冬和红白忍冬克隆得LjANR和rLjANR的CDS序列均为1002 bp,gDNA序列分别为2017和2026 bp,启动子序列分别为1170和1164 bp。LjANR和rLjANR均含有6个外显子和5个内含子,外显子长度一致,内含子差异较大,二者启动子序列中均含有大量光响应、激素应答、非生物胁迫应答元件。生物信息学分析发现,LjANR和rLjANR均编码333个氨基酸,均为稳定的疏水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽,二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲组成。序列比对及系统进化分析表明,LjANR和rLjANR蛋白与猕猴桃、茶树、油茶聚为一类,亲缘关系较近。qRT-PCR分析发现,LjANR和rLjANR均在花蕾中表达量最高,根中表达量最低,不同花期的表达量变化模式相似,S1和S2期表达量较高,然后表达量逐渐下降,至S4期达到最低,之后在S5期有一个缓慢的上升后表达量再次下降,两个品种中ANR基因的表达量在根、S2、S5期差异显著,茎、花蕾、S1、S3、S6期差异极显著。将LjANR基因构建到原核表达载体pET-32a上进行诱导表达,在59 kD处成功表达出目的蛋白。该研究为进一步研究ANR基因的功能奠定了基础,同时也为忍冬新品种的选育提供理论指导。

摘要：目的:从茯苓中克隆参与茯苓三萜合成路径中的潜在关键限速酶鲨烯环氧酶(SE),并对其进行生物信息学及表达分析。方法:采用试剂盒提取总RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物,以cDNA为模板,进行SE基因的克隆,对该基因进行生物信息学分析。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检查茯苓鲨烯环氧酶基因(PcSE)在茯苓神舟10号、湘靖28、5.78菌株中的表达。结果:PcSE的基因全长为1 571 bp,包含4个外显子,3个内含子。获得编码区域(CDS)序列长为1 413 bp,编码470个氨基酸。该蛋白为疏水性蛋白,无信号肽,有2个跨膜结构域,具有FAD/NAD(P)结合域和鲨烯环氧酶结构域,定位于线粒体或质膜上。与多孔菌科真菌的同源序列比对一致性为80.92%;系统进化树显示PcSE蛋白与美国茯苓的亲缘关系最近。Real-time PCR结果显示,PcSE基因在3个菌株中均有表达,在5.78菌株中的表达量最高,3个菌株的PcSE表达差异不存在统计学意义。结论:首次从茯苓中克隆并分析茯苓PcSE基因,为进一步研究茯苓PcSE的功能及解析茯苓三萜生物合成途径提供了基础。