摘要：目的　克隆表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 5 7∶H7紧密黏附素 (intimin)免疫保护性片段 (intiminC30 0 )。方法　设计引物采用PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增紧密黏附素及其免疫保护性片段的编码基因eae与eaeC30 0 ,T A克隆后构建原核表达质粒pET 2 8a(+) eae及pET 2 8a(+) eaeC30 0 ,经测序鉴定后转化E .coliBL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,PAGE检测。结果　PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增出了约 2 80 0bp和 90 0bp的目的片段 ;原核表达质粒pET 2 8a(+) eae及pET 2 8a(+) eaeC30 0经酶切及测序鉴定与预期序列一致。转化E .coliBL2 1 (DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约 2 5 %和 30 %;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量 (Mr)约 96× 1 0 3和 35× 1 0 3,破菌后电泳证实目的蛋白均以包涵体形式表达。结论　EHECO1 5 7∶H7紧密黏附素免疫保护性片段经基因克隆后获得了较高的表达量 ,为进一步的生物学性质及免疫学特性研究奠定了基础。

摘要：乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)在脂肪酸合成和分解代谢中发挥着重要作用.系统介绍了该酶的结构与分类、生物学作用与应用、抑制剂的类型与作用机理以及基因克隆4个方面的进展.ACC在大多数原核生物中为多亚基型酶,而在大多数真核生物中为多功能型单亚基酶,在天蓝色链霉菌和古菌勤奋金属球菌中为另外两种特殊类型;但都具备3个关键的功能域,即生物素羧化酶(BC)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)和羧基转移酶(CT).CT功能域作为潜在的靶标广泛应用于植物除草剂的筛选和哺乳动物肥胖、糖尿病等代谢疾病的药物设计中.ACC基因也成为转基因油料作物和生物柴油研究中重要的靶标基因.研究表明,植物质体中的β-CT亚基是多亚基型ACC的限制因子,而BCCP是脂肪酸合成的负调控因子.油脂的合成代谢十分复杂,且存在反馈抑制机制,因此克隆和表达ACC基因可以提高宿主中ACC的活性,但不一定能显著促进脂肪酸的积累.

摘要：目的克隆桑黄菌丝甾醇C14还原酶(ERG24)基因全长,并进行生物信息学及表达模式的初步分析。方法基于桑黄菌丝转录组数据设计PlERG24基因引物,采用PCR技术获得其cDNA全长序列,并通过Ex PASy等在线分析软件对其进行生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR技术分析该基因的表达模式。结果从桑黄菌丝中克隆到1 412 bp的PlERG24基因,开放阅读框长度为1326bp,编码441个氨基酸,理论相对分子质量为49358.61,等电点为5.28,为不含信号肽的疏水性蛋白,推测定位于质膜,具有6个磷酸化位点;系统进化树分析表明,该序列与暴马桑黄的ERG24基因同源性最高。表达模式分析表明,在桑黄菌丝生长的一个周期内,PlERG24基因表达在25d时达到最高6.36。结论获得了PlERG24基因全长序列,为进一步研究该基因的功能以及利用基因工程等手段改良麦角甾醇生物合成途径奠定基础。

摘要：目的克隆霍山石斛β-1,4-木糖基转移酶(IRX9)基因,并进行生物信息学、密码子偏性分析。方法根据霍山石斛转录组数据获得的IRX9基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术得到IRX9基因cDNA的全长序列,并进行生物信息学分析。结果霍山石斛IRX9基因全长1 553 bp,包含一个长度为1 047 bp的开放阅读框,编码348个氨基酸,理论相对分子质量为39 350,等电点为7.26,为不含信号肽的亲水性稳定蛋白,定位于质膜,具有多个磷酸化位点和糖基化位点。系统进化树表明,该序列与同科植物铁皮石斛的同源性最高,且具有GT-A超家族的保守区域"DXD"。密码子偏性分析表明,该基因偏好使用以A/T结尾的密码子,具有27个偏性密码子,烟草为该基因最适合的外源表达宿主。结论成功克隆IRX9基因,为从分子水平调控霍山石斛的生长发育和改善药材产量和品质提供理论基础。

摘要：为研究甘薯sporamin家族基因的结构和功能,通过对本实验室构建的甘薯转录组序列进行分析,设计相应引物并采用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,经TA克隆和序列测定,利用在线软件对甘薯sporamin结构进行分析和功能预测.从转录组数据库中共发现61条sporamin contigs,其中sporamin A家族有31条,sporamin B家族有30条,已从甘薯中克隆到6个sporamin A基因和10个sporamin B基因.所有sporamin A基因编码区全长660 bp,基因间序列一致性为95%以上;sporamin B基因编码区全长651 bp,基因间序列一致性达到98%;两个基因家族间序列一致性为84%.对克隆的sporamin A和sporamin B进行的数字表达谱分析结果表明,sporamin A和B在膨大初期的块根和成熟块根中的转录水平最高,在膨大中期转录水平较低,在叶片和茎中表达量极低.Sporamin氨基酸保守序列和同源比对结果显示,该蛋白质含有STI(Soybean Trypsin Inhibitor)保守序列,此序列有170多个氨基酸,属于Kunitz型蛋白酶抑制剂超家族,表明该蛋白具有蛋白酶抑制剂功能.

摘要：本研究从亚洲百合(Lilium Asiatic hybrids)花粉败育品种‘小小的吻’中克隆获得一个MYB转录因子基因LaMYB26。序列分析显示,LaMYB26基因的开放阅读框(ORF)长762 bp,编码253个氨基酸。结构域分析显示,LaMYB26含有2个典型的SANT结构域,属于MYB转录因子家族中的R2R3-MYB型。多序列比对发现,LaMYB26与其他物种的MYB类蛋白的氨基酸序列有57.78%的相似性。理化性质、亲/疏水性和无序化分析显示, LaMYB26转录因子是亲水性蛋白且偏碱性,存在无序化区域。信号肽和跨膜结构域分析表明,其不存在信号肽和跨膜结构域。空间结构分析显示, LaMYB26有2个典型的α-螺旋串联。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)显示, LaMYB26基因在败育时期表达量明显上调,且在花药中特异表达。结果显示, LaMYB26基因在百合花粉败育过程中可能发挥着重要作用,对LaMYB26的生物学信息学分析拟为深入研究其功能及作用机制提供参考。

摘要：目的获得粉尘螨瘦素受体叠加转录蛋白样1(Leptin receptor overlapping transcript-like 1,LepROTL1)的编码基因及其分子特征,并构建表达质粒。方法根据转录组测序结果,获得粉尘螨LepROTL1编码基因序列片段。据此设计引物,应用实时PCR技术从粉尘螨总RNA中扩增全长基因片段,构建原核表达质粒pET28a(+)-LepROTL1后测序。将该质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)T1R,异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blotting)鉴定表达产物。采用生物信息学软件分析该序列及其编码的蛋白质分子特征。结果 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示1个清晰条带;构建的质粒pET28a(+)-LepROTL1经测序显示,该编码基因从起始密码子ATG至终止密码子TAA共417 bp,该质粒转化大肠埃希菌后经IPTG诱导,SDS-PAGE见特异性条带,提示有表达。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白质由134个氨基酸组成,相对分子质量为14 378.13 Da,其亲水性指数为1.149,有一定疏水性;二级结构包括α-螺旋(19 aa,14.18%)、延伸主链(48 aa,35.82%)和无规卷曲(67 aa,50.00%)。将该基因推导出的氨基酸序列进行BLAST获得同源基因,构建的系统进化树中粉尘螨与屋尘螨聚成一簇。结论本研究获得了粉尘螨LepROTL1编码基因全长及其表达质粒,通过生物信息学分析获得其分子特征,为进一步研究该基因奠定了基础。

摘要：【目的】获得梨S-RNase基因全长序列及其进化、遗传多态性情况。【方法】设计特异性引物扩增梨S42-RNase基因组DNA全长序列,利用RT-PCR结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得其cDNA全长序列。构建梨属植物S-RNase基因编码区和高变区(hyper variable region,HV)内含子的系统发育树。【结果】梨S42-RNase基因编码226个氨基酸,包含由27个氨基酸组成的信号肽,由11、11、6、8、7个氨基酸组成的5个保守区以及HV区插入的335 bp内含子序列。系统进化树显示,梨S-RNase基因编码区和HV区内含子的拓扑结构既相似又有差异。编码区Normalized dN-dS结果显示,除了HV区外还有几个区域存在大量的非同义替换,表明对阳性选择具有很高的敏感性。【结论】梨S-RNase基因编码区和HV区内含子的进化存在一定的关联性,除HV区外还存在其他区域参与梨雌蕊与花粉间特异识别。梨S-RNase基因编码区进化动力源自其编码特异识别蛋白的功能,是平衡选择的结果。HV区的内含子序列表现出很高的长度多态性,进化受到负选择的压力。

摘要：本研究以多年生黑麦草‘高帽2号’叶片为试材,根据同源基因的CDS序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了多年生黑麦草γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因LpGCS。该基因全长为1674bp(GenBank登录号:KJ551844),具有完整的开放阅读框(ORF),共1125bp;对其氨基酸序列特性、结构以及与其他8种同源基因氨基酸序列间的同源性进行了研究,预测该蛋白分子量为42.86kDa,属于不稳定类蛋白质,其蛋白质二级结构以α-螺旋为主;蛋白质氨基酸序列与其他8种同源基因氨基酸序列间同源性都比较高;此外,成功构建了该基因的正、反义植物表达载体pCAMBIA-Ubi-LpGCS+和pCAMBIA-Ubi-LpGCS-,并通过农杆菌介导法获得转正、反义基因烟草。对转基因植株和野生型烟草进行镉离子胁迫试验,生理生化指标测试结果表明镉离子胁迫处理10d后,转LpGCS+植株中MDA含量低于野生型,光合色素含量与POD、SOD、CAT活性均高于野生型;而转LpGCS-植株中MDA含量高于野生型,光合色素含量与POD、SOD、CAT活性均低于野生型。综上所述,LpGCS基因在烟草中的过量表达可以提高植株的耐镉胁迫能力,为进一步利用该基因转化多年生黑麦草培育抗重金属植株奠定基础。

摘要：为了寻找和挖掘降解岩藻多糖的新型酶,以从海带中筛选获得的一株可以降解岩藻多糖的海洋黄杆菌Flavobacterium ***2-3为研究对象,对其进行了全基因组测序。通过与已报道的岩藻多糖酶氨基酸序列比对,并进行转录组学分析及实时荧光定量PCR验证,挖掘了1个可能的岩藻多糖酶基因,并将其命名为Fcn1。Fcn1基因全长1221 bp,编码406个氨基酸,蛋白分子质量约为46.8 kDa。通过引物设计、PCR扩增,将Fcn1基因克隆,进一步构建了Fcn1基因异源表达载体Fcn1-pET-28a(+),并将其成功地在大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主中进行了诱导表达。所得重组酶Fcn1通过带有His标签的镍柱进行分离纯化,采用铁氰化钾法测定纯化酶酶解岩藻多糖的比酶活(332 U/mg),纯化倍数为2.25。酶学性质研究表明,重组酶Fcn1最适反应温度为50℃,最适反应pH值为8.0,在20~30℃和pH值为7.0~8.0时表现出较好的稳定性。结合酶学性质研究结果,确定酶的最适反应条件为30℃,pH值为8.0,并测定了岩藻多糖酶水解反应的动力学参数,K m为1.17 mg/mL,V_(max)为10.53 g·L^(-1)·min^(-1)。该酶降解岩藻多糖的酶活力较高,在岩藻多糖资源的开发领域具有较大应用潜力。