摘要：以化学合成并证实抗菌活性和抗菌谱都高于天然抗菌肽的杂合肽ＣｅｃｒｏｐｉｎＡ１－１１Ｄ１２－３７的氨基酸序列为基础，选用酵母高频使用密码子设计了一种新型抗菌肽基因，基因合成采用二次ＰＣＲ（聚合酶链式扩增）方法．设计和合成的基因全长１４０个碱基对，包括氨基酸编码序列、起始密码子、终止密码子和两端限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ识别顺序，合成的基因克隆于ＰＣＲＴＭ２．１载体上．经ＤＮＡ序列分析证实，合成基因碱基序列与设计序列完全一致．

摘要：采用 PCR技术人工合成了一段长约 1 75 bp的人表皮生长因子 ( h EGF)的基因片段 .为了便于克隆 ,在该片段的 5′端设计了 Pst 的酶切位点及与 p US1 86载体 signal sequence相连接的碱基部分 ,在 3′端设计了 Hind 的酶切位点及终止密码子 .经 DNA测序分析 ,合成的片段与已发表的 h EGF在序列上完全一致 ;之后将其克隆至枯草杆菌分泌型质粒载体p US1 86上 ,构建重组载体 p USE并转化一株枯草杆菌突变菌株 BS992 0感受态细胞 ;以 PCR法快速筛选重组菌落 ,RIA检测结果表明 BS992 0阳性转化子能够表达和分泌 h

摘要：目的将水蛭素基因转入酵母系统中进行表达，以评价人工合成基因在真核系统中表达的可行性和探讨影响表达水平的因素。方法根据水蛭素变异体Ｉ（ＨＶ１）的氨基酸序列，选择酿酒酵母偏爱的密码子，设计了ＨＶ１基因。将ＨＶ１基因分１２个寡核苷酸片段，进行人工合成，并连接成一个完整的水蛭素基因。经ＰＣＲ扩增后，将扩增产物连到克隆载体ｐＢＳ－ＳＫ（＋）上并进行ＤＮＡ序列分析。用正确的ＨＶ１基因与酵母α因子信号肽基因相连，并一起插入酵母表达载体ｐＹＣ－ＤＥ，经鉴定表明，获得正确的重组表达质粒。将后者转入酿酒酵母ＢＪ１９９０细胞进行初步表达。结果在筛选出的阳性克隆的培养上清中，检测出的水蛭素活性为３０抗凝血酶单位（ＡＴＵ）／ｍｌ。所表达的量高于ＨＶ２在酵母中和ＨＶ１在原核系统的表达水平。Ｎ末端氨基酸序列与天然水蛭素一致。结论采用人工合成的ＨＶ１基因和较强的启动子在酵母中进行表达是一较好途径。

摘要：基因合成正日益成为基因获取的一种有效手段。两种常用的基因合成方法是基于PCR的基因合成(P法)和基于连接酶的基因合成(L法)。这两种方法都不是独立于所合成基因的序列内容的。文章首次提出了一种新的基因合成策略-等温单向生长法(Isothermal Unidirectional Elongation Method,IUEM),在3种酶的作用下,DNA链在等温状态下单向串行延伸,直到获得目标基因。由于引物设计成特殊的发夹结构,该方法可以做到合成过程独立于或部分独立于目标基因的序列内容。本文探索了该策略的实验可行性,检测了影响基因合成的各种因素,并利用该方法成功地合成了一段254bp和一段300bp的DNA序列。

摘要：凝乳酶在奶酪加工中应用广泛,为获得高活性的凝乳酶制剂,采用乳酸克鲁维酵母为宿主,首次对经密码子优化的牛凝乳酶原基因进行表达。利用DNAWorks3.0软件辅助设计,用两步PCR法合成了小牛凝乳酶原基因(GenBank Accession ***30448)。将该基因插入酵母表达载体pKLAC1,构建了重组载体pKLAC1-Prochy,并用电脉冲法将线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中。通过含1%酪蛋白的YEPD平板活性筛选,PCR鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌chy1。该菌株可分泌表达牛凝乳酶原,经SDS-PAGE分析,证明重组牛凝乳酶原的分子量约为41kDa,符合预期大小,酸化处理后为36kDa,证明可以正确自我剪切。液体培养96h后,酶活最高达到99.67SU/mL。分别以半乳糖和葡萄糖为碳源的条件下表达,其酶活性差异不大,说明在发酵期间,可以不经过半乳糖诱导即可产生高水平的牛凝乳酶原产物。该工程菌的获得为进一步优化产酶条件及放大工艺提供了条件,并为凝乳酶的工业化生产奠定了基础。

摘要：本文报导了用于基因重组与基因合成实验设计的软件系统的建立.此系统由30个功能模块组成,为研究者提供了包括在DNA分子上寻找限制性内切酶位点、核酸分子片段之间同源性比较,基因化学合成的实验设计、特定顺序分析引物及核酸杂交探针的设计、阅读框的查找等功能.此外,本系统可以对外来数据库的资料进行援引和进一步分析,为分子生物学的研究提供有价值的信息.

摘要：目的　在毕赤酵母表达系统中获得大量构象正确的 3D7/MSP1 4 2重组蛋白进行疫苗有效性试验。方法　采用不对称PCR法拼接合成了 3D7/msp1 4 2基因 (12 0 2bp) ,用电穿孔法将合成基因导入毕赤酵母并进行诱导表达 ,用免疫印迹法检测表达产物。结果　按毕赤酵母密码子使用频率重新设计并全合成了 3D7/msp1 4 2基因序列 ,该合成基因在毕赤酵母系统 (Pichiapastoris)中得到高水平分泌表达 ,产生全长重组蛋白。识别构象表位的特异性单克隆抗体能与该重组蛋白反应。结论　重新设计的基因能在毕赤酵母中高水平分泌表达 ,并产生构象正确的重组蛋白 。

摘要：为利用基因工程技术获得垂体腺苷酸环化酶激活肽 (pituitaryadenylatecyclaseactivatingpolypeptide ,PACAP) ,根据大肠杆菌的密码偏好性 ,设计并人工合成编码 38个氨基酸的PACAP基因 .克隆到表达载体pET 35b(+) ,构建重组质粒pET PACAP ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)pLysS+ .实现纤维素结合域 (cellulosebindingdomain ,CBD)与PACAP融合蛋白的表达 ,并在两者之间引入 (凝血 )因子Ⅹa识别位点 (Ile Glu Gly Arg↓ ) .融合蛋白CBD PACAP经纤维素亲和层析纯化后 ,因子Ⅹa酶切释放PACAP .在因子Ⅹa识别位点前引入 7个氨基酸的柔性短肽 (Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly)明显提高了融合蛋白对因子Ⅹa的敏感性 .HPLC进一步纯化得到纯度大于 95 %PACAP多肽 .所得的PACAP多肽的Western印迹鉴定为阳性 ;激光飞行质谱测定分子量结果与理论值相符 .生物活性分析表明 ,所制备的PACAP具有促进胰腺癌细胞株SW 1

摘要：目的通过人工合成猪γ干扰素(poIFN-γ)基因的编码序列,提高目的蛋白的表达。方法根据poIFN-γ的氨基酸序列,选择大肠杆菌所偏爱的密码子,设计并合成了24个寡核苷酸片段。通过重叠区扩增法,利用PCR合成poIFN-的成熟蛋白编码基因,克隆入pGEM-7Zf(+)载体,转化大肠杆菌TG1。经测序证实后,构建原核表达载体pBV222/poIFN-γ并转化大肠杆菌DH5α,经诱导表达后,进行SDS-PAGE分析及纯化。结果酶切及测序结果表明表达载体构建成功,工程菌诱导表达后的电泳图谱在相对分子质量约16500的位置出现明显的目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的55%,占包涵体中总蛋白的80%,经Ni2+-NTA亲和层析纯化,纯度达90%以上。结论已获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对猪γ干扰素进行复性及活性研究奠定了基础。

摘要：报道了水蛭素全基因的合成及克隆。根据已知水蛭素氨基酸序列及酵母菌体内蛋白质表达特性 ,设计了水蛭素的全基因序列 ,采用化学合成及酶学相结合的方法 ,合成了该基因片段 ,并逐段克隆至载体 pBS上 ,得到全长水蛭素基因。序列测定表明 ,克隆后DNA顺序同原设计序列。