摘要：目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白核酸酶9(CRISPR-associated nuclease 9,Cas9)基因编辑技术构建稳定遗传的脂多糖结合蛋白(lipopolysaccaride binding protein,Lbp)基因敲除小鼠。方法根据C57BL/6J小鼠的Lbp基因序列特征,设计sgRNA靶点,删除Lbp基因5’-端蛋白编码保守序列并引入移码突变,使编码LBP失活。提取F0、F1、F2、F3代小鼠基因组,PCR鉴定并测序验证Lbp基因敲除效果,RT-PCR测序验证Lbp基因转录水平,蛋白质印迹法验证F2代LBP蛋白表达水平。结果F0代获得5只杂合子敲除小鼠(Lbp^(+/-))、F1代获得3只Lbp+/-小鼠,F2代获得4只Lbp纯合子敲除小鼠(Lbp^(-/-)),F3代获得30只Lbp^(-/-)小鼠。RT-PCR测序表明,Lbp^(-/-)小鼠mRNA缺失244 bp且发生移码突变,导致翻译提前终止。蛋白质印迹证明Lbp^(-/-)小鼠肝脏组织中无LBP蛋白表达。结论通过CRISPR/Cas9技术成功构建可以稳定遗传的Lbp基因敲除小鼠,为后续进一步研究LBP的免疫及其生理作用提供基础。

摘要：目的:制备Trim26/ZNF173条件性基因敲除小鼠,为研究Trim26基因在肝癌发生中的作用及其机制提供动物模型。方法:设计基因敲除策略,Trim26的外显子5~7缺失引起的移码突变会破坏蛋白结构域,进而导致Trim26蛋白功能丧失。为此,我们拟删除Trim26基因的外显子5~7,以借助Cre/lox P系统构建Trim26基因条件性敲除的小鼠。简单地说,先获得嵌合体小鼠,选择高嵌合率小鼠与B6/N小鼠交配获得F1代Trim26fl/wt基因型的杂合子小鼠。F1代杂合子小鼠自交得到F2代Trim26fl/fl基因型的纯合小鼠和对照野生型小鼠。提取鼠尾基因组DNA并行PCR鉴定基因型,在DNA水平确定小鼠的基因型。结果:成功构建了打靶载体,打靶载体经限制性内切酶线性化后,成功电转导入了B6/BLU ES 细胞中,ES克隆经过LR-PCR初筛及Southern blot进一步验证,确定得到了3株中靶ES细胞(即3D、6A和10F),将中靶ES细胞扩增后进行囊胚注射,获得了12只Trim26的嵌合体小鼠(嵌合率不小于50%)。选择性成熟后的高嵌合率小鼠与B6/N小鼠交配繁育,得到F1代小鼠,PCR鉴定基因型确认获得了Trim26fl/wt基因型的F1代杂合子小鼠。性成熟后的F1代杂合子小鼠合笼交配后得到F2代小鼠,PCR鉴定基因型确认获得了纯合的Trim26条件性基因敲除小鼠(基因型为Trim26fl/fl)。结论:成功制备了Trim26条件性基因敲除小鼠,为进一步解析Trim26在肝癌发生中的作用及机制打下了良好基础。

摘要：目的建立瞬时性受体电位通道香草酸受体亚型6(Trpv6)基因敲除小鼠模型,为在体研究Trpv6的生物学功能及其与骨代谢关系奠定基础。方法从Ensembl数据库中获得小鼠Trpv6基因组序列。设计基因敲除策略,构建基因敲除载体pBR322-MK-Trpv6。以电穿孔方法将基因敲除载体导入胚胎多能干细胞(ES细胞),用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆。PCR鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆。将正确同源重组的ES细胞注射到C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合体小鼠。挑选嵌合率在50%的雄鼠与C57BL/6J小鼠交配,获得的灰鼠经PCR鉴定为杂合子小鼠。杂合子小鼠交配后获得纯合子小鼠。结果成功构建了打靶载体pBR322-MK-Trpv6。电穿孔后,共获得24个正确同源重组的克隆,同源重组效率为25%。同源重组的克隆经显微注射后,共获得4只嵌合率大于50%的雄鼠。嵌合鼠与C57BL/6J小鼠交配,获得57只来源于ES细胞的灰鼠,PCR鉴定证实其中17只为杂合子小鼠,阳性率为29.8%。杂合子小鼠交配获得纯合子小鼠。经蛋白质印迹分析证实纯合子小鼠无Trpv6蛋白的表达。结论成功建立了Trpv6基因敲除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象。

摘要：目的繁殖及鉴定NLRP3基因敲除(NLRP3-/-)小鼠。方法将引进的NLRP3基因敲除杂合子小鼠,单独进行饲养及配种繁殖,繁殖后其子代出现3种基因型:野生型、杂合子型及纯合子型,提取每只小鼠的基因组DNA,用PCR和T7E1酶切方法进行鉴定,将获得的纯合子小鼠与异性杂合子交配,以获得更多的基因敲除纯合子小鼠。结果 NLRP3杂合子小鼠的饲养及繁殖均获得成功,获得了NLRP3基因敲除纯合子和杂合子小鼠。结论正确的饲养、繁殖及鉴定方法是从NLRP3基因敲除杂合子小鼠中获得纯合子小鼠的有效途径。

摘要：目的 利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠。方法 针对miR-223基因设计双重sgRNAs,将体外转录的sgRNAs和Cas9 mRNA共同显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行PCR扩增和测序以鉴定基因型,同时取小鼠肝脏研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miR-223在肝脏中的表达。结果 设计了miR-223基因双重sgRNAs并对其进行了体外转录,纯化后显微注射小鼠受精卵细胞获得miR-223基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有3种基因型,一种为6 bp的缺失突变,但未对miR-223序列产生影响;另外两种为162 bp和168 bp的缺失突变,完全删除miR-223前体和成熟区序列。与野生型相比,这两种小鼠肝组织中几乎不能检测到miR-223的表达。结论 设计双重sgRNAs并应用CRISPR/Cas9技术成功构建miR-223全基因敲除小鼠。

摘要：目的：应用CRISPR/Cas9技术构建去泛素化酶YOD1基因敲除小鼠。方法：针对YOD1基因设计单链向导RNA（sg RNA）识别序列,构建sg RNA质粒,与Cas9质粒体外转录、纯化后注射入受精卵,通过PCR和测序验证得到F0代阳性小鼠。配繁两代后,取同窝对照的野生型（WT）和敲除（KO）小鼠的主要组织器官研磨,使用免疫印迹（WB）技术检测各组织YOD1蛋白的表达,确证YOD1敲除小鼠模型是否成功建立。统计YOD1杂合子（HET）自交存活后代各基因型比例,分析是否有胚胎致死表型。解剖小鼠分析主要组织器官的表型,进一步利用H.E.染色分析KO小鼠是否存在自发的病理改变。通过血糖耐受实验（GTT）分析KO小鼠的血糖调控能力。结果：基因组测序和WB检测结果显示KO小鼠中YOD1被明显敲除,YOD1敲除小鼠模型成功建立。YOD1杂合子自交后代各基因型比例符合孟德尔定律,提示KO小鼠非胚胎致死。YOD1敲除小鼠肝脏显著小于WT小鼠。GTT结果表明敲除YOD1不影响小鼠的血糖稳态。结论：应用CRISPR/Cas9技术成功构建YOD1基因敲除小鼠。KO小鼠正常出生,无任何胚胎发育缺陷。与WT小鼠相比,KO小鼠肝脏显著减小,但无显著的自发病理变化,KO小鼠血糖控制亦无显著差异。

摘要：目的运用CRISR/Cas9技术敲除小鼠基因组中Bmp9基因片段,构建Bmp9基因敲除小鼠。方法根据Bmp9基因的外显子序列,设计一段sgRNA并合成。sgRNA体外转录后和Cas9mRNA混合后显微注射受精卵细胞,注射后的受精卵细胞移植至受体动物获得子代小鼠。提取子代小鼠基因组DNA测序鉴定其基因型。基因型鉴定正确的小鼠与野生型交配后筛选纯合子小鼠。同时取纯合子小鼠心脏、肝、脾、肺、肾,匀浆后提取总RNA和总蛋白,通过qPCR、WB和免疫组化检测BMP9在各组织中的表达。结果设计并合成20bp的sgRNA并进行体外转录,显微注射并回植后得到基因突变小鼠,连续交配后得F2代纯合子。测序结果显示,突变小鼠存在两种基因型,一种为5bp缺失突变,另一种为13bp缺失并伴有1bp插入突变。与野生型C57BL/6相比,qPCR、WB和免疫组化结果均表明基因敲除小鼠肝中BMP9表达显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建出了BMP9基因敲除小鼠。

摘要：目的:通过尿烷多次给药初步验证自主建立的P53^(+/-)基因敲除小鼠(B6-Trp^(tm1)/NIFDC)模型是否比野生型C57BL/6小鼠对尿烷敏感,为国内用于药物临床前安全评价致癌实验短期体内试验提供可用的基因修饰动物模型。方法:在C57BL/6来源的ES细胞中,通过打靶技术敲除p53基因的第2~5外显子后对获得的P53^(+/-)基因敲除小鼠进行PCR基因型鉴定,再与普通C57BL/6小鼠杂交,获得的后代再通过PCR筛选获得基因敲除动物(命名为B6-Trp^(tm1)/NIFDC)。尿烷验证试验共设计3个组,阴性对照组(野生型小鼠):给予生理盐水,尿烷组1(P53^(+/-)敲除小鼠):给予尿烷,尿烷组2(野生型小鼠):给予尿烷,给药方式为腹腔注射共给药3次,给药剂量为1 000 mg·kg^(-1)。给药后第8周开始肿瘤触诊观察,每周1次。给药后6个月后进行计划剖解,通过大体剖检和组织病理学检查以评价P53^(+/-)敲除小鼠对尿烷致癌作用的敏感性。结果:成功获得杂合的P53^(+/-)基因敲除小鼠,给予尿烷后可诱发P53^(+/-)敲除小鼠发生肝脏血管扩张、肺腺瘤、颌下腺血管瘤及脾脏淋巴瘤,病变发生率分别为94.4%、33.3%、5.6%、5.6%;野生型小鼠肝脏血管扩张及肺脏腺瘤的发生率分别为36.8%、10.5%;阴性对照组无肿瘤发生。结论:本研究初步验证自主建立的P53^(+/-)基因敲除小鼠对尿烷的致癌敏感性高于野生型小鼠,该模型有望将来是临床前药物安全性评价致癌性实验短期体内试验候选模型之一。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建Bpi基因敲除的小鼠模型,并继续繁殖、鉴定及建立稳定遗传的Bpi基因敲除小鼠品系。方法针对C57BL/6小鼠Bpi基因的第2~3外显子两端设计敲除靶点,筛选高活性gRNA(guide RNA)靶点,体外转录得到sgRNA(small guide RNA)并与Cas9 mRNA一起显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵内,经胚胎移植至代孕母鼠体内,获得F0代小鼠后,通过基因型鉴定和DNA测序获得基因突变的阳性子代鼠。结果筛选到高活性gRNA靶点并成功获得体外转录产物sgRNA;与Cas9 mRNA一起通过显微注射的方式获得了64枚状态良好的受精卵并成功移植到2只代孕母鼠体内;获得了22只F0代小鼠,经PCR鉴定和DNA测序后选择一只单链缺失708 bp碱基的阳性小鼠进行扩繁,并在F1、F2代检测到该突变,且F2代成功繁育出纯合子小鼠。结论成功构建Bpi基因敲除小鼠模型,为进一步研究Bpi基因及其表达产物的生物学功能奠定了基础。

摘要：目的应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。