摘要：目的利用簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑系统构建质粒并敲除裸鼹鼠皮肤成纤维(NMR skin fibroblasts,NSF)细胞HIF-1α基因,为研究裸鼹鼠的耐低氧机制及缺氧相关疾病的发生发展机制提供体外细胞模型。方法针对裸鼹鼠HIF-1α基因的1~4号外显子区域设计4对sgRNA序列,并成功构建表达质粒。筛选得到最优sgRNA后,转染HEK-293T细胞收集上清液测定病毒滴度。前期用pLenti-Cas9(blast)病毒感染NSF细胞,后用制备的HIF-1α-sgRNA病毒感染表达Cas9蛋白的NSF细胞。经药筛后观察荧光表达,同时提取细胞gDNA和蛋白。通过T7E1酶和Western Blot检测NSF细胞中HIF-1α基因变化及蛋白表达情况。结果Sanger测序显示,所设计的sgRNA成功插入到pX459和pKLV2-U6-sgRNA2载体上,序列验证正确,重组质粒构建成功;T7E1酶切实验成功切除3条带,sgRNA的打靶效率为54%,Western Blot结果表明,经药筛后的裸鼹鼠NSF细胞HIF-1α基因敲除成功,蛋白水平显著降低(P=0.0019);且未发现HIF-1α敲除细胞形态的明显变化,基因敲除对细胞增殖能力无明显影响。结论成功构建靶向裸鼹鼠HIF-1α基因的CRISPR/Cas9质粒,且质粒靶向敲除HIF-1α基因功能验证成功,将有利于裸鼹鼠耐低氧机制研究,并为人类缺氧相关疾病防治提供理论依据。

摘要：目的构建髓系特异性Spi1基因敲除小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础。方法根据CRISPR/Cas9技术原理和Cre/LoxP系统,设计并构建sgRNA和Donor载体,以第2号外显子(Exon 2)所在的转录本为敲除区域,在Exon 2两侧各放置同向Loxp元件;将Cas9蛋白、sgRNA和Donor载体混合显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,移植受精卵到假孕的C57BL/6J母鼠的子宫中,19~20 d后获得F0代。将阳性F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配,得到稳定的F1代Spi1^(flox/+)小鼠。F1代Spi1^(flox/+)小鼠雌雄自交得到Spi1^(flox/flox)小鼠。Spi1^(flox/flox)与Lyz2-Cre^(+)小鼠交配得到Spi1^(flox/+)/Lyz2-Cre^(+)小鼠,再将其与Spi1^(flox/flox)交配,得到的Spi1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(+)小鼠为髓系特异性Spi1基因敲除(KO)小鼠;Spi1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(-)小鼠作为野生型(WT)小鼠。提取WT和KO小鼠DNA,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型;Western blot检测WT和KO小鼠免疫细胞中脾病灶形成病毒前病毒整合癌基因-1/富含嘌呤盒1(PU.1)表达。结果PCR鉴定结果显示,采用flox引物鉴定时仅扩增出220 bp条带的小鼠,即基因型为Spi1^(flox/flox)纯合子,采用Lyz2-Cre引物鉴定时扩增出700 bp的小鼠,基因型为Lyz2-Cre^(+);Western blot结果显示,与WT组比较,KO组小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)和腹腔原位巨噬细胞(PM)中的PU.1不表达(P<0.01);T细胞中KO小鼠PU.1表达水平与WT小鼠差异无统计学意义;PCR和Western blot结果均表明髓系特异性Spi1 KO小鼠构建成功。结论成功构建和鉴定髓系特异性Spi1 KO小鼠,为进一步揭示PU.1在免疫调节中的潜在机制研究提供动物模型基础。

摘要：目的 采用CRISPR/Cas9技术构建吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)基因敲除的THP-1细胞株,为研究IDO1在巨噬细胞中的作用提供细胞模型。方法 设计靶向IDO1基因的3条向导RNA(guide RNA,gRNA),分别构建IDO1-gRNA重组质粒,酶切及测序鉴定后,包装成Lenti-IDO1-gRNA慢病毒。利用Cas9慢病毒感染THP-1细胞获得稳定表达Cas9蛋白的细胞株,再经Lenti-IDO1-gRNA慢病毒感染敲除IDO1基因,有限稀释法获得单克隆细胞株。T7E1酶切检测gRNA打靶效率,PCR产物测序和Western blot鉴定IDO1基因敲除效果。CCK8法检测IDO1基因敲除对THP-1细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测对巨噬细胞标志物CD11b、CD68和CD14表达的影响,中性红法检测巨噬细胞吞噬功能。结果 成功构建了3种IDO1-gRNA重组质粒,3条gRNA均能有效编辑IDO1基因,以gRNA2编辑效率最高。经PCR产物测序和Western blot验证获得了3株THP-1 IDO1-KO单克隆细胞株,并发现IDO1基因敲除可抑制THP-1细胞增殖,下调THP-1巨噬细胞CD11b、CD68表达,上调CD14表达,增强THP-1巨噬细胞吞噬功能。结论 成功构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株;IDO1对THP-1细胞增殖活性、分化调节以及THP-1巨噬细胞吞噬功能调节有重要作用,为后续进一步探讨IDO1基因在巨噬细胞中的功能及机制研究奠定基础。

摘要：目的基于CRISPR/Cas9技术构建前枯草杆菌蛋白原转换酶9(Preprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,针对PCSK9基因靶序列设计单链向导RNA(sgRNA),将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵,获得F0代敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得PCSK9基因敲除(PCSK9 KO)纯合子小鼠。采用PCR方法对PCSK9 KO小鼠进行基因鉴定,Western Blot检测肝组织PCSK9及低密度脂蛋白受体(LDL-R)蛋白的表达,同时检测心、脑、肾、脂肪组织中的PCSK9蛋白表达水平,q-PCR检测PCSK9的mRNA表达水平。采用酶法检测血清中总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平。结果PCR产物凝胶电泳以及PCSK9蛋白及mRNA表达结果表明成功获得全身性PCSK9基因敲除小鼠,肝组织LDL-R(3.42±0.56)蛋白表达显著增高。与WT组相比,PCSK9小鼠血清TC(90.75±17.81 mg/dL vs 54.19±2.42 mg/dL)、TG(81.26±11.98 mg/dL vs 50.92±11.93 mg/dL)显著降低(P<0.001)。结论基于CRISPR/Cas9技术成功构建获得PCSK9基因敲除小鼠,敲除PCSK9基因通过上调肝脏LDL-R蛋白显著降低血脂水平。

摘要：目的通过基因敲除和转录组测序探究CXCR2相关功能基因及信号通路,揭示其在宫颈癌中的分子作用。方法设计构建靶向CXCR2基因的CRISPR-Cas9敲除质粒载体,转染HeLa细胞并筛选获得CXCR2基因敲除的细胞株。转录组测序分析差异表达基因,并进行基因本体(GO)分类富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析筛选信号通路和重要差异表达基因,差异表达基因经实时荧光定量PCR方法验证。结果成功构建了CXCR2基因敲除细胞株,转录组测序获得1519个差异表达基因,其中上调表达基因428个,下调表达基因1091个。GO富集分析显示了细胞组分、生物学过程、分子功能方面富集量前20的条目;KEGG信号通路富集分析显示,富集基因最多的为肿瘤相关通路,其次为PI3K-Akt信号通路和HPV感染信号通路。通过韦恩图分析获得了7个共同差异表达基因:EGF、FN1、ITGA2B、CCND3、PIK3CD、PDGFRB、CDKN1A,其中前6个基因表达显著下调,CDKN1A表达显著上调。结论转录组测序分析结果进一步提示CXCR2在宫颈癌中发挥作用,并初步确定了与其相关的信号通路和关键功能基因,为宫颈癌的分子机制和临床研究提供了理论基础。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9技术构建分选连接蛋白9(sorting nexin 9,SNX9)基因敲除小鼠模型并对其表型进行分析。方法针对C57BL/6小鼠SNX9基因第3~5外显子,设计gRNA靶位点并在体外转录获得sgRNA,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F0代阳性敲除小鼠。通过繁育及基因型鉴定获得SNX9基因敲除纯合子小鼠(SNX9^(-/-)小鼠);取小鼠尾部组织提取DNA,用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定;提取SNX9基因敲除小鼠脑组织蛋白,用Western blot检测SNX9蛋白和小胶质细胞标志蛋白的表达水平;记录SNX9基因敲除小鼠的繁殖率和体重,并与野生型小鼠比较;步态系统分析SNX9基因敲除小鼠的步态情况;苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠脑组织的形态结构。结果F1代杂合子(SNX9^(+/-))小鼠繁育后可获得3种基因型:野生型(SNX9^(+/+))、杂合子(SNX9^(+/-))、纯合子(SNX9^(-/-));鼠尾提取的DNA用聚合酶链反应(PCR)能鉴定出小鼠的基因型,SNX9敲除小鼠脑组织的SNX9蛋白表达显著低于野生型小鼠;SNX9基因敲除小鼠可正常生长繁殖,但繁殖率显著低于野生型小鼠(P0.05);SNX9基因敲除小鼠脑组织形态学特征与野生型小鼠相比无明显差异;SNX9基因敲除小鼠脑组织的小胶质细胞标志蛋白表达水平与野生型小鼠相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用CRISPR/Cas9技术成功获得SNX9基因敲除小鼠,为研究SNX9基因的生物学功能和调控机制提供了实验动物模型。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠水通道蛋白9(AQP-9)基因,构建稳定敲除AQP-9基因的纯合子AQP-9^(-/-)小鼠。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在Ensembl数据库上找到AQP-9基因序列的外显子区域,综合分析选定AQP-9-202的公共外显子2,前期在其两边设计7个小向导RNA(sgRNA)靶点,选择合适靶点,将AQP-9敲除。用PCR以及基因测序手段检测基因敲除效果。获得F1代杂合子小鼠后,继而提供10只野生型小鼠(雌雄各5只)进行繁育,以期得到纯合子AQP-9^(-/-)小鼠。结果前期设计的7个sgRNA靶点基因活性均在95%以上,选择L2和R2作为最终的sgRNA靶点。注射受精卵74枚,移植60枚,得到6只F0代阳性鼠。经过繁育鉴定,最终得到稳定敲除AQP-9基因的纯合子AQP-9^(-/-)小鼠。结论利用CRISPR/Cas9系统获得全身敲除AQP-9基因且可稳定遗传的纯合子AQP-9^(-/-)小鼠。

摘要：细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶-2(CDK2)是细胞通过和进入S期所必须的细胞周期调节激酶,与许多癌细胞的生长有关。然而,目前在山羊上关于CDK2基因敲除及相关功能的研究尚未见报道。研究采用CRISPR/cas9系统,首先设计CDK2基因的sgRNA片段,在合成CDK2 sgRNA核苷酸序列后,构建能够同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY-CDK2 sgRNA,连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对转化子进行验证,最后转染HEK293T细胞,检测细胞荧光和细胞增殖。酶切和测序结果证明,CDK2基因敲除载体构建正确;荧光显微镜检测显示,细胞转染效率在75%以上;细胞增殖检测表明,山羊CDK2敲除质粒不会对人源细胞增殖产生影响。说明采用CRISPR/Cas9构建的载体,可为后续获得山羊CDK2基因缺失型细胞系,研究支原体肺炎感染引发的细胞凋亡分子机制提供理论依据。

摘要：目的构建并鉴定刚地弓形虫RH株巨噬细胞迁移抑制因子(Tgmif)基因敲除虫株。方法设计刚地弓形虫RH株Tgmif的单向导RNA(sgRNA)和点突变引物,将pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒定点突变为针对Tgmif基因的pSAG1::Cas9-U6::sg Tgmif质粒。构建含有Tgmif上游1001 bp(Tgmif-up)、二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶基因(dhfr-ts)和Tgmif下游1011 bp(Tgmif-down)等3个片段的Tgmif供体质粒,从Tgmif供体质粒PCR扩增获得Tgmif供体DNA。将pSAG1::Cas9-U6::sg Tgmif质粒和Tgmif供体DNA混合后电击转染野生型刚地弓形虫RH株(RH_(WT))速殖子,用乙胺嘧啶培养7 d,筛选获得稳定表达乙胺嘧啶抗性的虫株并进行单克隆筛选,PCR扩增dhfr-ts上、下游同源臂和Tgmif鉴定Tgmif基因敲除单克隆株(RH_(ΔTgmif))。提取RH_(ΔTgmif)和RH_(WT)株虫体蛋白,蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析TgMIF蛋白的表达情况。RH_(ΔTgmif)在人包皮成纤维(HFF)细胞中传代10代,吉氏染色,镜检计数100个HFF中速殖子数,评估RH_(ΔTgmif)在体外培养HFF细胞中的增殖能力,以RH_(WT)为对照。将20只BABL/c小鼠随机分为RH_(WT)组和RH_(ΔTgmif)组(10只/组),各组分别腹腔注射RH_(WT)或RH_(ΔTgmif)株速殖子(1000个/鼠),记录小鼠生存情况。弓形虫增殖能力的比较采用独立样本t检验,小鼠生存率的比较采用Log Rank检验。结果PCR检测结果显示,含Tgmif-up、dhfr-ts和Tgmif-down等3个片段的Tgmif供体DNA片段长5049 bp,与预期相符;RH_(ΔTgmif)株分别扩增出1387、1524 bp的dhfr-ts上、下游同源臂条带,RH_(WT)株无相应条带;RH_(WT)株扩增出1837 bp的Tgmif条带,RH_(ΔTgmif)株无相应条带。Western blotting分析结果显示,RH_(WT)株在相对分子质量(M_(r))12500处出现1条蛋白条带,RH_(ΔTgmif)株无相应的蛋白条带。吉氏染色镜检结果显示,100个HFF中RH_(ΔTgmif)株速殖子为(2986±69.20)个,高于RH_(WT)株的(2067±51.08)个(t=18.50,P<0.01)。体内毒力试验结果显示,RH_(WT)组小鼠在第7天出现死亡,在第9天全部死亡;RH_(ΔTgmif)组小鼠在第5天出现死亡,第7天全部死亡,两组之间的差异有统计学意义(χ^(2)=17.45,P<0.01)。结论成功构建Tgmif基因敲除弓形虫虫株RH_(ΔTgmif),RH_(ΔTgmif)株的毒力比RH_(WT)株强。

摘要：背景:HLA-DR基因异常表达与多种肿瘤的进展及预后相关,采用CRISPR/Cas9技术编辑子宫内膜癌HLA-DRA基因的研究目前国内外尚未见报道。目的:利用CRISPR/Cas9技术对HEC-1-A细胞的HLA-DRA基因靶向敲除,检测其敲除效率,并初步探索HLA-DRA基因的功能。方法:根据HLA-DRA基因序列,针对HLA-DRA外显子设计单链向导RNA(sgRNA),分别将sgRNA、CRISPR/Cas9、增强绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性克隆至YKO载体中,通过脂质体将sgRNA表达质粒转染到HEC-1-A细胞中。根据荧光表达,观察评估sgRNA敲除效果后,使用表达sgRNA的质粒进行转染,用最佳浓度的嘌呤霉素筛选,获得稳定的绿色荧光蛋白阳性表达细胞后,进行PCR、基因测序、转录组测序。结果与结论:经转染和嘌呤霉素筛选后,获得稳定表达绿色荧光蛋白的HEC-1-A细胞,对其进行Sanger测序分析,结果显示HEC-1-A细胞中HLA-DRA第一号外显子基因被定向敲除,对转录组测序结果进行差异基因筛选,根据筛选所得686个差异表达基因进行GO富集分析和KEGG富集分析,构建蛋白互作网络图,通过对肿瘤增殖分化有关差异基因分析发现COL3A1、BCL2A1、TACSTD2、CXCR2等基因表达上调,GNG11、BMP7、IL1RN、PLEK2、CDH6等基因表达下调。结果可见,HLA-DRA基因参与了多种器官、组织和细胞的功能调控过程。此外,HLA-DRA基因可能通过2种途径(上调/下调)调控子宫内膜腺癌细胞的增殖、分化、迁移及侵袭过程。此研究建立了CRISPR/Cas9技术联合脂质体转染子宫内膜癌细胞的单质粒基因敲除方法,首次敲除子宫内膜癌免疫相关基因HLA-DRA,为子宫内膜癌免疫治疗的研究奠定实验基础。