摘要：目的 用基于多重PCR (multiplex PCR,mPCR)扩增子的二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术(mPCR-NGS)检测MTB的耐药基因突变,并评估其检测石蜡包埋组织标本诊断耐药结核病的临床应用价值.方法 选取北京市昌平区结核病防治所2013年4月至2015年10月常规进行了利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星和氧氟沙星比例法检测且具有药敏试验结果的50株MTB临床分离株,包括42株耐药MTB和8株敏感MTB菌株.参考耐药基因数据库及相关文献,针对以上8种抗结核药物主要耐药基因及常见位点设计耐药基因组合,建立有效的检测方案.收集首都医科大学附属北京胸科医院病理科2017年11月至2018年9月耐药结核病患者55例的石蜡包埋组织标本,探针熔解曲线法检测结果为利福平、异烟肼、乙胺丁醇和氟喹诺酮类至少存在一种耐药相关基因突变.首先对已知表型药敏试验结果的MTB临床分离株进行mPCR-NGS检测,验证该方法检测纯菌样本的有效性,再进一步检测结核病患者石蜡包埋组织标本进行临床验证.主要评价指标为敏感度和特异度以及一致性.结果 以比例法为金标准,mPCR-NGS检测利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇的敏感度分别为95% (38/40)、93%(27/29)、93% (27/29)和72%(13/18),特异度分别为100%(10/10)、95% (20/21)、100%(21/21)和94%(30/32);二线注射类药物卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星敏感度均为100% (2/2,3/3,3/3),特异度分别为98%(47/48)、100%(33/33)和100%(47/47);氧氟沙星的敏感度为70%(7/10),特异度为100%(40/40).总符合率为94%,一致性检验Kappa值为0.87.纳入的55例石蜡包埋组织标本经探针熔解曲线法检测,28例利福平耐药,37例异烟肼耐药,13例乙胺丁醇耐药,17例氟喹诺酮类耐药.mPCR-NGS与探针熔解曲线法比较,利福平、异烟肼、乙胺丁醇和氟喹诺酮类的敏感度分别为100%(28/28)、95%(35/37)、100%(13/13)和100%(17/17);特异度均为100%(27/27,18/18,42/42,38/38).两种方法总符合率为99%,一致性检验Kappa值为0.98.结论 mPCR-NGS检测MTB临床分离株及结核病患者石蜡包埋组织标本耐药基因突变的敏感度、特异度和符合率较高,有望成为耐药结核病准确、快速的分子病理诊断新技术.

摘要：目的探讨高通量基因拷贝数变异(CNV)检测在前庭水管扩大(EVA)诊断中的应用价值。方法设计一种基于双重连接和多重荧光PCR的高通量连接探针扩增(HLPA)分析方法,对2014年5月至2016年12月就诊于中南大学湘雅医院的46例非综合征型EVA患者行3个EVA相关基因(SLC26A4、FOXI1和KCNJ10基因)的拷贝数变异检测,用GeneMapper v4.1进行数据分析。对照组为100名听力正常,无其他遗传疾病的健康志愿者。结果共检测46例EVA患者,男32例,女14例,年龄1~26岁。在4例EVA患者中检测到SLC26A4基因1~3号外显子缺失(4/46,8.7%),该CNV在健康人群DGV(人类基因组结构变异数据库)以及文献中未见报道,且在100名正常对照中未检出。未检测到FOXI1和KCNJ10基因的拷贝数变异。结论本研究应用HLPA技术以EVA的已知基因为靶向区域进行CNV检测,是对耳聋基因点突变检测的补充,有助于实现EVA的精准基因诊断。

摘要：目的通过基因芯片技术进行全基因组拷贝数变异(CNV)分析,筛查与食管鳞状细胞癌(ESCC)放射敏感相关性的基因。方法 选择2013年12月至2016年8月安阳市肿瘤医院放疗科接受单纯放疗且该院病理中心留存有活组织检查石蜡标本的ESCC患者,分为放疗敏感组和放疗抗拒组。对两组患者的石蜡标本进行DNA提取,利用美国Affymetrix公司的OncoScan Array平台设计的基因芯片检测人全基因组CNV,筛选两组样本的基因片段差异。结果共收集到19例ESCC患者的标本进行DNA提取,为方便配对分析,从DNA样品质检合格的患者中选取10例,其中放疗敏感组和放疗抗拒组各5例。两组患者性别、年龄、病变部位、病变长度、放疗剂量差异均无统计学意义(均P>0.05).杂合性缺失(LOH)是主要的CNV类型。放疗抗拒组中,10号染色体q24.32-q24.33区域与18号染色体q21.2-q21.31区域检测到LOH的频率为100%,而在放疗敏感组中未检测到。放疗敏感组中,4号染色体q27-q28.1区域检测到LOH的频率为80%,而在放疗抗拒组中未检测到。结论10q/18q LOH与ESCC放射抗拒相关,4q LOH与ESCC放射敏感相关。

摘要：目的 :通过巢式PCR及特异引物,建立一种新的乙肝病毒(HBV)DNA rtA181T耐药突变的PCR直接扩增检测方法。方法:巢式PCR方法第1轮扩增HBV DNA逆转录酶rt活性域片段,第2轮PCR上游引物3′末端碱基设计为与HBV DNA rtA181T突变碱基相同的碱基,扩增出的目的基因片段,即为突变片段。利用该方法 ,本文检测了43例HBV DNA rtA181T变异标本,分析该方法检测的灵敏性;并比较分析低拷贝HBV DNA水平与高拷贝HBV DNA水平下,该方法与PCR-Sanger测序法检测HBV DNA rtA181T突变的一致性。结果:产物经测序证实,突变检测引物巢式PCR法能扩增出HBV DNA rtA181T耐药突变。在HBV DNA水平为24 U/μL、rtA181T突变株含量低至10%时,该方法仍能较好检测出rtA181T变异片段。对43例不同拷贝水平的HBV DNA rtA181T耐药变异临床标本检测显示,该方法检测灵敏性达100%,常规PCR-Sanger测序灵敏性为74%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 :基于巢式PCR及突变引物为基础的HBV DNA rtA181T耐药突变PCR直接检测法能较好地检测HBV DNA rtA181T耐药变异发生;对HBV DNA低拷贝水平下的rtA181T耐药变异检测,该方法灵敏性优于Sanger测序法,且有较好的特异性。这对早期发现HBV DNA耐药突变、及时更改抗HBV治疗策略具有重要临床指导意义。

摘要：目的用基于多重PCR(mutiplex PCR,mPCR)扩增子的二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术(mPCR-NGS)检测MTB的耐药基因突变,并评估其检测石端包埋组织标本诊断耐药结核病的临床应用价值。方法选取北京市昌平区结核病防治所2013年4月至2015年10月常规进行了利福平、异烟阱、乙胺丁醇、链霉素、卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星和氧氟沙星比例法检测且具有药敏试验结果的50栋MTB临床分离株,包括42株耐药MTB和8株敏感MTB菌株。参考耐药基因数据库及相关文献,针对以上8种抗结核药物主要耐药基因及常见位点设计耐药基因组合,建立有效的检测方案。收集首都医科大学附属北京胸科医院病理科2017年11月至2018年9月耐药结核病患者55例的石蜡包埋组织标本,探针熔解曲线法检测结果为利福平、异烟腓、乙胺丁醇和氟喹诺酮类至少存在一种耐药相关基因突变。首先对已知表型药敏试验结果的MTB临床分离株进行mPCR-NGS检测,验证该方法检测纯菌样本的有效性,再进一步检测结核病患者石蜡包埋组织标本进行临床验证。主要评价指标为敏感度和特异度以及一致性。结果以比例法为金标准,mPCR-NGS检测利福平、异烟阱、链霉素和乙胺丁酶的敏感度分别为95%(3840)、93%(2729)、93%(217129)和72%(13/18),特异度分别为100%(10/10)、95%(20/21)、100%(21/21)和94%(30/32);二线注射类药物卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星敏感度均为100%(22,3/3,3/3),特异度分别为9%(47148)、100%(3/33)和100%(4747),氧氟沙星的敏感度为70%(710),特异度为100%(40/40)。总符合率为94%,一致性检验Kappa值为0.87。纳人的55例石蜡包埋组织标本经探针熔解曲线法检测,28例利福平耐药,37例异烟腆耐药,13例乙胺丁醇耐药,17例氟喹诺酮类耐药。mPCR-NGS与探针熔解曲线法比较,利福平、异烟阱、乙胺丁醇和氟喹诺郦类的敏感度分别为100%(28/28)95%(35/37)、:100%(13/13)和100%(17/17);特异度均为100%(27/27,18/18,42/42,38/8)。两种方法总符合率为99%,一致性检验Kappa值为0.98。结论mPCR-NGS检测MTB临床分离株及结核病患者石蜡包埋组织标本耐药基因突变的敏感度、特异度和符合率较高,有望成为耐药结核病准确、快速的分子病理诊断新技术。

摘要：目的建立结核分枝杆菌耐药相关基因多重PCR反应体系，评估该体系以临床分离株DNA和痰菌DNA为模板扩增耐药相关基因的成功率。方法常规提取结核分枝杆菌临床分离株（47株）及涂阳肺结核患者（21例）痰菌DNA。根据目前研究已发现的结核分枝杆菌耐药相关基因合成引物，建立2个多重PCR体系以扩增目的基因。扩增片段经测序证实后，计算该体系用于两种样本的扩增成功率。结果针对临床常用8种抗结核药物，选取结核分枝杆菌中rpoB、katG、inhA、embB、gyrA、rpsL、Ⅲ、P担共8个耐药相关基因设计合成引物。建立2个多重PCR体系扩增8个耐药基因，该体系扩增47株结核分枝杆菌l临床分离株DNA和21例菌阳肺结核患者痰菌DNA的成功率分别为100．0％（47／47）和76．2％（16／21）。结论本研究建立了高效扩增8个结核分枝杆菌耐药基因的多重PCR体系，结果对进一步研发结核病耐药分子诊断产品具有重要意义。

摘要：目的建立结核分枝杆菌耐药相关基因多重PCR反应体系，评估该体系以临床分离株DNA和痰菌DNA为模板扩增耐药相关基因的成功率。方法常规提取结核分枝杆菌临床分离株（47株）及涂阳肺结核患者（21例）痰菌DNA。根据目前研究已发现的结核分枝杆菌耐药相关基因合成引物，建立2个多重PCR体系以扩增目的基因。扩增片段经测序证实后，计算该体系用于两种样本的扩增成功率。结果针对临床常用8种抗结核药物，选取结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、embB、gyrA、rpsL、rrs、eis共8个耐药相关基因设计合成引物。建立2个多重PCR体系扩增8个耐药基因，该体系扩增47株结核分枝杆菌临床分离株DNA和21例菌阳肺结核患者痰菌DNA的成功率分别为100．0％（47／47）和76．2％（16／21）。结论本研究建立了高效扩增8个结核分枝杆菌耐药基因的多重PCR体系，结果对进一步研发结核病耐药分子诊断产品具有重要意义。