摘要：目的　寻找用于基因转染的pH敏感脂质体的最佳处方和制备工艺。方法　采用正交设计法 ,考虑制备的pH值、组成摩尔比、制备方法三因素 ;即 1个四水平因素和 2个二水平因素混合状态。选用L16(4 1·2 12 )正交设计表安排试验 ,各水平组合条件下 ,通过基因转染实验 ,以基因转染荧光测定值作为观测指标 ,实验重复 4次。结果　在基因与脂质体重量比为 (1∶8)时 ,组成大豆磷脂与DC 胆固醇摩尔比为 (6∶4)和在超声法制备的特定条件下 ,pH5 .4与pH7.4基因转染荧光测定值之间差别非常显著 ;均值都较大 ,但是以 pH5 .4时基因转染荧光测定值均值最大。 结论　基因转染荧光测定值最高的脂质体为在 pH5 .4、组成大豆磷脂与DC 胆固醇摩尔比为 (6∶4)时采用超声法制备的脂质体。

摘要：设计并合成了聚谷氨酸-聚乙二醇@碳酸钙(PPG@CaCO3)纳米遮蔽体系,用于遮蔽聚乙烯亚胺(PEI)。一方面,聚谷氨酸-聚乙二醇(PPG)可以降低PEI引起的细胞毒性,更有利于体内应用;另一方面,CaCO3可有效改善PPG导致的转染效率下降,并在一定程度上提高PEI的细胞转染效率。对比遮蔽体系PPG@CaCO3和聚谷氨酸-聚乙二醇@磷酸钙[PPG@Ca3(PO4)2]发现,PPG@CaCO3在微酸性环境中释放二氧化碳气体是提高细胞转染效率的关键因素。小鼠体内循环实验表明,PPG@CaCO3遮蔽体系可以增加载体在血液中的循环时间。因此,PPG@CaCO3遮蔽体系对于改善阳离子类基因载体的体内应用起到重要作用。

摘要：目的探讨Napsin A基因转染至A549细胞对其上皮-间质转化(EMT)的作用和机制。方法采用慢病毒载体质粒PLJM1构建重组质粒PLJM1-Napsin A,将Napsin A基因转染至A549细胞染色体中并鉴定。用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激A549细胞构建体外EMT模型,倒置显微镜下动态观察细胞形态学的变化,观察Napsin A基因转染对A549细胞在体外EMT模型中细胞EMT和表达黏着斑激酶(FAK)的影响。结果重组质粒PLJM1-Napsin A测序结果与设计序列完全符合,转Napsin A基因A549细胞表达Napsin A蛋白显著高于非转基因细胞组(P<0.01)。细胞经TGF-β1刺激后形态上演变为间质细胞,E钙蛋白的mRNA和蛋白表达水平明显下调(P<0.01),相反Ⅰ型胶原则显著上调(P<0.01),提示体外构建EMT模型获得成功。转Napsin A基因A549细胞在TGF-β1干预后,其细胞形态间质改变、E钙蛋白和Ⅰ型胶原的表达量也发生相似变化趋势,但变化幅度显著变小(其中E钙蛋白:P<0.01,Ⅰ型胶原:P<0.05)。体外EMT模型中,细胞FAK蛋白表达量增多(P<0.01),但转基因细胞上调趋势明显小于未转基因细胞(P<0.01)。结论转染Napsin A基因至A549细胞可以部分阻滞细胞EMT进程,其作用机制可能与抑制整合素信号转导通路有关。

摘要：背景:碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用。目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况。设计、时间及地点:细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成。材料:日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科。pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品。方法:抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代。参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xholⅠ、BamHⅠ双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株。主要观察指标:骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达。结果:流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性。转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在Mr23000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带。结论:实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达。

摘要：背景:自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷。胞嘧啶脱氨酶即可产生强大的旁观者效应。目的:观察脂质体介导真核表达载体胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达。设计、时间及地点:细胞学基因水平体外实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。材料:SPF级C57BL纯系小鼠6只,体质量18～20g,用于骨髓间充质干细胞的分离培养。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供。LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品。方法:取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,提取质粒DNA,对质粒plRES2-cGFP1-CD进行XhoI和BamHI双酶切,用于转染。取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用LipofectamineTM 2000介导法转染第3代鼠骨髓间充质干细胞。主要观察指标:重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测鼠骨髓间充质干细胞表面标记表达,荧光倒置显微镜观察细胞转染36,48h后胞嘧啶脱氨酶基因的表达。结果:质粒plRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0～1.5kb处有1条带出现,符合胞嘧啶脱氨酶基因长度。流式细胞仪检测显示细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性。plRES2-AcGFP1-CD基因转染36h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白表达,48h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强。结论:脂质体介导的胞嘧啶脱氨酶基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48h后达峰值。

摘要：背景:在众多的骨生长因子中,骨形态发生蛋白2具有显著促进骨缺损修复和骨折愈合的效果。骨修复是一个阶段性过程,不需要转染的目的基因长久表达,因此利用腺病毒载体将目的基因导入脂肪间充质干细胞来促进骨愈合比较理想。目的:观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后大鼠脂肪间充质干细胞的分化情况。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-01/10在北京大学第三医院中心实验室完成。材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,由北京大学实验动物学部提供。腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-GFP由靳小兵博士构建扩增。方法:胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,传至第3代分为Ad-BMP2转染组、Ad-GFP转染组和未转染组。各转染组分别向培养液中加入对应的腺病毒液,转染复数MOI=100。主要观察指标:转染后脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶活性,vonKossa染色结果,Westernblotting法检测骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达。结果:与未转染组比较,转染后7,14,21dAd-GFP转染组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化;Ad-BMP2转染组细胞碱性磷酸酶活性明显增高(P<0.01),且随时间延长碱性磷酸酶活性增加更为显著。Ad-BMP2转染组vonKossa染色出现黑色钙结节,免疫细胞化学染色结果示胞浆内有大量黄染颗粒,骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2均呈明显强阳性表达。Westernblotting检测结果显示Ad-BMP2转染组脂肪间充质干细胞骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2表达水平增高,Ad-GFP转染组中未检测到骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2的表达。结论:大鼠脂肪间充质干细胞经腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后,可定向分化为成骨细胞。

摘要：背景：自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷。胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase,CD）即可产生强大的旁观者效应。目的：观察脂质体介导真核表达载体CD基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达。设计、时间及地点：细胞学基因水平实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。材料：SPF级C57BL纯系小鼠6只,由大连医科大学实验动物中心提供。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供。LipofectamineTM2000脂质体为Invitrogen产品。方法：取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒DNA,对质粒pIRES2-AcGFP1-CD进行XhoI和BamHI双酶切,用于转染。取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用Lipofectamine2000介导法转染第3代骨髓间充质干细胞。主要观察指标：重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记表达,细胞转染后CD基因的表达。结果：质粒pIRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0-1.5kb处有一条带出现,符合CD基因长度。细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性。pIRES2-AcGFP1-CD基因转染36h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白的表达,48h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强。结论：脂质体介导的CD基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48h后达峰值。

摘要：背景:平滑肌细胞增殖移行和血小板激活导致血栓形成是移植血管再狭窄的主要原因,一氧化氮可以抑制上述生物反应,但内皮型一氧化氮合酶基因转染是否可以抑制种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生还未得到证实。目的:拟进一步观察内皮型一氧化氮合酶基因转染对种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生的影响。设计、时间及地点:重复观察测量,于2006-04/2007-05在西安交通大学医学院中心实验室及分子生物学实验室完成。材料:1月龄新西兰大白兔1只,用来获取平滑肌细胞。成年新西兰大白兔18只,随机分成3组,正常对照组植入未转染的人工血管,LacZ转染组植入种植转染lacZ的平滑肌细胞的人工血管,内皮型一氧化氮合酶转染组植入种植内皮型一氧化氮合酶的平滑肌细胞的人工血管,6只/组。方法:构建含有报道基因lacZ和内皮型一氧化氮合酶基因的假型反转录病毒载体小鼠白血病病毒/疱疹性口炎病毒G糖蛋白,并转染平滑肌细胞。将转染了基因的细胞种植在人工血管上,并用血管旁路移植的方法植入兔腹主动脉。主要观察指标:瓜氨酸法检测细胞培养上清中一氧化氮含量。移植血管内膜X-gal染色观察,种植的平滑肌细胞为蓝色,而内源性细胞为红色。显微镜下测量血管内膜增生厚度。结果:18只兔均进入结果分析。内皮型一氧化氮合酶转染组一氧化氮含量明显高于正常对照组(P0.05);植入100d,正常对照组与内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度基本相似(P>0.05),两组明显均低于lacZ转染组(P<0.05)。结论:内皮型一氧化氮合酶基因转染可抑制种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生。

摘要：背景：基因工程是目前软骨修复的主要方法，脂肪间质干细胞以其来源丰富、取材容易、免疫相容性良好、体外培养可以较长时间保持分化表型、有较强的向软骨细胞转化的能力而成为理想的种子细胞。目的：探讨胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间质干细胞增殖的影响。设计、时间及地点：细胞学基因转染体外观察，于2006-03／2007-03在中国医科大学细胞生物实验室完成。材料：成年新西兰大白兔3只，由中国医科大学实验动物中，心提供。含有全长人胰岛素样生长因子1cDNA片段的质粒***-1由吉林大学徐莘香教授惠赠。方法：取兔颈后皮下脂肪，Ⅰ型胶原酶消化法体外分离培养兔脂肪间质干细胞。取传至第2代细胞，以．0．5×10^6/孔密度接种于6孔板，细胞融合至90％-95％时随机分为未转染组、转染空载体pcONA3．1组、转染质粒pcDNA3．1-hlGF-1组，采用脂质体介导基因转染法进行质粒pcDNA3．1-IGF-1转染，经G418筛选后培养4周。主要观察指标：采用RT-PCR及Westernblot方法检测胰岛素样生长因子1的表达情况，MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果：转染pcDNA3．1-hlGF-1组的脂肪间质干细胞内有大量胰岛素样生长因子1mRNA及蛋白表达，未转染组及转染空载体pcDNA3．1组无表达。细胞增殖曲线显示，转染质粒pcDNA31-hlGF-1组的脂肪间质干细胞增殖速度较其他2组细胞明显加快。流式细胞仪检测显示，转染质粒pcDNA3．1-hlGF．1组的脂肪间质干细胞较其他2组细胞的S期比例显著增加（户〈0．05），G1期比例显著下降（P〈0．05）。结论：质粒pcDNA3．1-IGF-1转染兔脂肪间质干细胞后，可以获得稳定表达，并能明显促进脂肪间质干细胞的增殖。

摘要：背景:现阶段诱导骨髓基质细胞分化成骨的方法大致分为在化学药物作用、细胞因子作用以及转基因作用下的分化等。目的:观察腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓基质细胞成骨能力的影响。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和骨关节科完成。材料:人骨髓基质细胞取自健康成年男性自愿者。人血管内皮生长因子165基因重组腺相关病毒、β半乳糖酐酶基因重组复制缺陷性腺相关病毒由课题组前期构建。方法:抽取健康志愿者髂前上棘骨髓,采用全骨髓法分离培养人骨髓基质细胞。体外扩增纯化后取50%融合的P2代细胞,随机分为4组:腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组向细胞培养液中加入人血管内皮生长因子165基因重组腺相关病毒1×1010OPU/mL,孵育24h后换为普通完全培养液继续培养。β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组加入半乳糖酐酶基因重组复制缺陷性腺相关病毒,其余处理与前组相同。阳性对照组向培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。空白对照组仅加入普通完全培养液,不进行特殊处理。主要观察指标:全自动生化分析仪检测培养上清碱性磷酸酶活性,免疫组化染色观察血管内皮生长因子的表达,Von Kossa染色检测人骨髓基质细胞中骨胶原结节形成。结果:处理后2周,腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组与阳性对照组的培养上清碱性磷酸酶活性基本相似(P>0.05),而β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组、空白对照组的培养上清碱性磷酸酶活性均明显降低(P<0.01)。血管内皮生长因子主要在骨髓基质细胞的胞浆内表达,腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组阳性细胞数明显多于其他3组。腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组和阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成,明显多于β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组、空白对照组。结论:基因重组腺相关病毒人血管内皮生长因子165转染对人骨髓基质细胞成骨能力具有促进作用。