摘要：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)是萜类化合物前体物质合成途径2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate,MEP)途径的第一个限速酶,在甘草次生代谢过程中发挥着重要的调控作用。本课题组在前期转录组研究中发现DXS基因表达水平与甘草的指标性成分甘草酸的含量呈负相关,因此本文拟通过毛状根培养体系,从基因过表达和沉默两方面开展研究,解析DXS基因对甘草酸生物合成的调控作用。本文克隆了甘草DXS基因(GenBank注册号:MN158121);采用基因融合法构建了过表达载体pCA-DXS;根据DXS第一外显子设计sgRNA序列,构建了CRISPR/Cas9基因编辑载体pHSE-DXS;以甘草胚轴为外植体材料,采用发根农杆菌介导法诱导了DXS基因过表达和表达沉默的甘草毛状根体系。同时,诱导了野生型甘草毛状根及含空质粒的阴性对照毛状根。采用UPLC法测定各甘草毛状根样品中甘草酸的含量,结果显示:DXS基因沉默组毛状根样品中甘草酸含量显著高于野生型和阴性对照组,而DXS基因过表达甘草毛状根样品中甘草酸含量则显著低于野生型和阴性对照组。本文通过逆向遗传学策略,从基因过表达和沉默两个方面证实了DXS基因对甘草酸生物合成的负调控作用,为解析DXS基因在萜类化合物代谢中的作用提供了理论依据,也为进一步构建甘草酸生物合成分子调控网络奠定了基础。

摘要：阿魏酸5-羟化酶(ferulate 5-hydroxylase,F5H)是苯丙烷代谢途径上的关键酶。本课题组前期转录组测序研究显示F5H基因在甘草酸生物合成过程中起负调控作用,因此本文拟克隆该基因,并从基因过表达和沉默两个方面对这一调控作用进行深入研究。本文克隆得到甘草F5H基因(GenBank注册号:MK882511);以pCAMBIA1305.1为载体骨架,以Spe I和Bgl II为酶切位点,利用基因融合法构建过表达载体pCA-F5H;根据F5H第一外显子设计sgRNA序列,以pHSE401为载体骨架,以BsaⅠ为酶切位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体pHSE-F5H;使用电转法将pCA-F5H和pHSE-F5H分别转入发根农杆菌ATCC15834感受态细胞;以甘草胚轴为外植体材料,利用发根农杆菌介导法分别诱导F5H过表达及沉默甘草毛状根系。同时,构建野生型甘草毛状根以及携带空质粒的阴性对照甘草毛状根。利用UPLC法测定各甘草毛状根系中甘草酸的含量,结果显示F5H基因沉默甘草毛状根体系中甘草酸含量显著高于野生型和阴性对照组,而过表达F5H基因甘草毛状根系中甘草酸含量则显著低于野生型和阴性对照组。本文通过逆向遗传学策略,从基因过表达和沉默两个方面证实了F5H基因对甘草酸生物合成的负调控作用,为进一步构建甘草酸次生代谢分子调控网络奠定了基础。

摘要：为研究小反刍兽疫病毒H基因过表达后对病毒增殖的影响,根据G en Bank中小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria 75/1 H基因序列,设计1对引物扩增H基因全长编码区序列,并将其连接至真核表达载体p EGF P-C 3上,经鉴定正确后转染CHS-20细胞,并通过R T-PCR、荧光观察及W estern-blot分别在m RNA和蛋白水平检测H基因的表达。结果表明,H基因在CHS-20细胞内得到了表达。将p EGFP-C3-PPRV H重组质粒、空载体p EGFP-C3转染CHS-20细胞,待H基因表达后,接种PPRV Nigeria 75/1,病毒增殖一定时间后,以β-actin作为内参基因,采用相对荧光定量RT-PCR法研究病毒增殖量的变化。结果表明,相对于未转染及转染空载体p EGFP-C3的细胞,转染p EGFP-C3-PPRV H重组质粒的细胞PPRV增殖量得到了提高,且差异显著(P<0.05),这说明在CHS-20细胞中过表达PPRV H基因能促进PPRV增殖。

摘要：　　摘　要　目的:观察Cyr61基因过表达对人肾小管上皮细胞 (HKC)凋亡的影响,探讨Cyr61在常染色体显性多囊肾病(ADPKD)发病中的作用及机制。　方法:RT PCR扩增Cyr61基因全长,构建pcDNA3. 1 +Cyr61重组质粒,转染并筛选获得稳定转染pcDNA3. 1+Cyr61的HKC细胞。经RT PCR、Northern、Westernblot鉴定转染细胞系基因的整合及表达。对空白HKC、空质粒pcDNA3. 1转染的HKC、Cyr61转染的HKC和囊肿衬里上皮细胞去血清培养 72h后,流式细胞仪检测细胞凋亡指数,Westernblot检测磷酸化Akt和Bad含量。　结果:构建了pcDNA3. 1+Cyr61重组质粒并获得稳定转染该质粒的HKC细胞。空白HKC与质粒pcDNA3. 1转染组之间上述指标无显著差异(P>0 05),Cyr61基因转染组与空白组、pcDNA3. 1转染组相比,凋亡指数显著降低 (P0. 05);在Cyr61抗体存在下,Cyr61基因转染组的上述指标与空白组无显著差异 (P>0 .05 )。　结论:过表达Cyr61的HKC对去血清诱导的凋亡特性与囊肿衬里上皮细胞相似,过表达的Cyr61可能通过自分泌途径,促进Akt和Bad磷酸化,抑制细胞凋亡,参与ADPKD囊肿形成和发展。

摘要：目的构建Purα基因过表达以及SiRNA慢病毒表达载体,通过包装病毒,以用于神经系统细胞感染及原代培养神经元的基因操作。方法 1)过表达载体的构建:本实验使用pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒载体,PCR扩增Purα全长基因,然后亚克隆到pCDH载体相应的多克隆位点之中,进行酶切和测序鉴定;2)ShRNA慢病毒表达载体的构建:根据shRNA的特征,设计shRNA的DNA序列以及其反向互补序列,然后合成并克隆到慢病毒载体pLKO.1-puro的相应位点中。3)慢病毒包装和滴度测定:将克隆好的pCDH-Purα和pLKO.1-puro-shRNA载体和病毒包装质粒pCMV-VSVG、pCMV-dR8.2 dvpr按相应的比例转染到293FT细胞中,48h后收集上清液,纯化、浓缩,进行滴度测定。结果测序结果证实所插入片段相位正确,转染后通过RT-PCR和Western blot证实过表达组Purα基因表达增高,而沉寂组的Purα表达抑制,达到实验设计要求,可以用于实验研究。结论利用本方法可以快速地进行目的基因的基因操作,省时、节约,与同类型的方法比较,具有较大的优越性,可以在实验中推广应用。

摘要：果蝇zeste基因增强子同源物2（EZH2）是组蛋白甲基转移酶。研究表明EZH2在前列腺癌中起关键作用[1]。我们应用GibsonAssembly法构建了pWPI-HA-EZH2慢病毒载体。一、材料与方法***载体PacI和PmeI双酶切后，削平黏性末端，去磷酸化。2．以pCMV-HA-EZH2质粒为模板，设计引物，序列：上游：CTCAGGAATTTCGACATTTTAAA佃IAATGGCATACCCATACGAT-GTTCCA，下游：TCCTGCAGCCCGTAGTTTTCAAGGGATITCCAT-TTCTCTTT。聚合酶链反应（PCR）扩增目的片段，回收产物。

摘要：[目的]采用慢病毒系统构建AMP依赖的蛋白激酶α1(AMP activated protein kinase α1,AMPKα1)基因过表达的3T3-L1细胞系,探讨其对炎症因子表达水平的影响。[方法]在美国国家生物技术信息中心(NCBI)上查找到AMPKα1的基因序列,利用SnapGene软件设计引物,进行目的基因扩增、纯化。将纯化后的AMPKα1片段克隆到PLJM1-EGFP载体质粒上,构建好的质粒与辅助质粒共同转染到HEK293T细胞中,收集病毒液。用含有病毒液的培养基培养3T3-L1细胞,待抗性蛋白表达后用嘌呤霉素筛选,杀死未成功转染的3T3-L1细胞,更换新鲜的完全培养基继续培养。[结果]成功构建稳定过表达AMPKα1的3T3-L1细胞系(P<0.05);AMPKα1过表达的3T3-L1细胞系的炎症因子MCP-1蛋白表达水平降低(P<0.05),炎症减轻。[结论]过表达3T3-L1细胞中的AMPKα1,减轻炎症因子MCP-1的表达水平(P<0.05)。