摘要：目的寻找一种敏感、特异的方法检测弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)bcl-2/IgH基因重排,并通过测定产物的序列,以了解所建方法的可靠性。方法运用专业引物设计软件设计bcl-2/IgH基因重排半巢式PCR引物,对52例经临床病理确诊的DLBCL石蜡包埋组织及10例慢性扁桃体炎患者的新鲜扁桃体组织通过半巢式递降温度梯度PCR(touch down PCR)扩增,检测bcl-2/IgH基因重排,并对其产物进行克隆和序列分析。结果通过一步法检测到bcl-2/IgH基因重排8例,其中DLBCL6例,新鲜扁桃体组织2例;进行第2次半巢式PCR时仅在DLBCL中发现5例阳性,新鲜扁桃体组织均阴性。将阳性产物在网上序列分析显示:一步法检测到的8例中有3例为假阳性,而半巢式PCR扩增出的5例均为bcl-2/IgH基因重排片段。3例假阳性的片段分别与人类第19号染色体BAC331191,LLNLR-245D11基因片段及1号染色体RP11-498P10基因片段同源。结论常用的检测bcl-2/IgH基因重排引物扩增结果存在一定假阳性,其机制可能是因为人类基因组中存在与常用引物同源性较高的序列。为研究设计的引物与传统的引物结合,进行半巢式PCR可以排除这种假阳性扩增,提高诊断的准确性。

摘要：目的应用多重PCR方法检测初诊成人急性淋巴细胞白血病（ALL）患者的克隆性免疫球蛋白（Ig）和T细胞受体（TCR）基因重排，为实时定量RT—PCR（RQ—PCR）法监测ALL患者体内的微量残留病（MRD）奠定基础。方法参照BIOMED－2协作组制定的Ig和（或）TCR检测方法，设计96条不同的PCR引物，分成14个混合管，通过多重PCR，分别检测患者骨髓单个核细胞的IgH、IgK、TCRB、TCRG、TCRD克隆性基因重排。结果在22例成人B系ALL患者中，Ig克隆性重排检出率为96％，其中IgH为86％，IgK为14％。在18例成人T系ALL患者中，TCR克隆性重排检出率为100％，其中TCRB为83％，TCRG为78％，TCRD为39％。两个及两个以上克隆性标志物的检出率在B和T系ALL中分别为91％（22例中20例）和89％（18例中16例）。结论BIOMED－2协作组设计的14管多重PCR引物和方法，几乎可检测到淋巴细胞白血病患者体内所有占优势的克隆性T、B细胞增殖群体，方法简便、可靠、覆盖面广，适用于成人ALL患者基凶重排检测和MRD监测。

摘要：目的 应用实时定量PCR（RQ-PCR）方法 检测患者的免疫球蛋白重链（IgH）基因重排,探讨其在成人B系急性淋巴细胞白血病（ALL）患者的微量残留病（MRD）动态监测中的意义.方法 15例B系ALL患者的初诊DNA标本经PCR扩增莺排的IgH基因,克隆产物经基因测序、序列比对后,根据每例患者的克隆特异性序列信息,利用软件设计15条等位基因特异性寡核苷酸（ASO）引物,作为RQ-PCR检测的上游引物,合成通用的JH下游引物和TaqMan探针,监测患者随访标本MRD靶分子.7例Ph＋患者同时用RQ-PCR检测bcr-abl融合基因转录本.结果 使用ASO引物RQ-PCR法扩增15例患者IgH重排靶基因的敏感性为10-3～10-5,荧光背景信号未显示或较低.动态监测表明：高危组患者诱导完全缓解（CR）后体内MRD水平明显高于标危组患者,诱导CR后MRD〉10-3的患者复发率（71.4%）高于MRD≤10-3的患者（12.5%）,MRD〉10-3的患者生存时间短.另外,Ph＋患者bcr-abl融合基因转录本的对数级变化趋势与IgH重排靶基因水平的动态变化一致.结论 使用ASO引物RQ-PCR方法 检测IgH基因重排,具有敏感性高、特异性强、结果 可靠等优点,可对肿瘤克隆进行准确定量.B系ALL患者体内IgH基因重排水平与临床治疗反应和疾病预后密切相关,可用于患者病情的随访监测.

摘要：目的:建立检测人T细胞TCRBD基因(Diversity Gene)经历重排的连接介导PCR方法(Ligation Mediate dPCR,LMPCR),为T细胞重排和疾病的关系研究提供基础。方法:在人TCRβ链BD1与BD25′端重组信号序列(RSS)前,BD1与BD23′端RSS后各设计两套用于巢式PCR引物;设计并合成和双链RSS平断裂末端相接的特殊接头(BWLinker),提取胸腺组织、正常人和急性T淋巴细胞白血病(TALL)外周血单个核细胞(PBMC)样本总DNA,和BWlinker连接,进行巢式PCR,PCR产物琼脂糖电泳分析,阳性产物做胶回收,并克隆测序鉴定。结果:在1例胸腺组织提取的总DNA中证实存在BD1和BD25′和3′的RSS断裂末端,在2例TALLs的PBMC中检测到BD25′和3′的RSS断裂末端,2例正常人PBMC中未能检测到RSS断裂末端,阳性的LMPCR产物通过测序鉴定,和基因组中序列完全相符合。结论:1例胸腺组织和2例TALL的PBMC中检测到RSS断裂末端,提示TCRBD基因正经历重排,测序结果表明建立的监测TCR重排的LMPCR方法可靠,可用于T细胞重排模型和相关疾病的机制研究。

摘要：外套细胞淋巴瘤（Mantle cen lynlphonla，MCL）的诊断目前主要依靠其形态特征，但易与其他淋巴瘤相混淆。因此，寻找一种敏感而特异的分子标志将有助于对该病的明确诊断。染色体t（11；14）主要见于MCL，其分子对应物是bcl- 1基因重排，尽管bcl-1的断裂点分散于11ql3区内，但其中一半以的断裂点集中在一个Ikh大小、被称为主要易位簇（majortranslocation Cluster，MrC）的区域内~[1]。在发生在相对更小的区域内，正是断裂点相对集中的特点，使得咒R技术适用于这种易位的检测。我们研究的目的在于设计一种特异和敏感的半巢式PCR方法来检测MCL中的bcl一l基因重排，并检查该方法在检测石蜡标本时与新组织结果的一致性。

摘要：目的 研究毛囊黏蛋白沉积症与蕈样肉芽肿的关系。方法 从8例特发性毛囊黏蛋白沉积症、3例毛囊黏蛋白沉积症合并蕈样肉芽肿和1例蕈样肉芽肿患者获得病变组织，将其埋于石蜡中。设计T淋巴细胞受体（TCR）可变区引物Vγ1-8／A，Vγ10，Vγ11及β，利用PCR方法分析了12例患者组织中T淋巴细胞受体基因重排的情况。结果 8例特发性毛囊黏蛋白沉积症中1例，3例毛囊黏蛋白沉积症合并蕈样肉芽肿和1例蕈样肉芽肿患者皮损TCR Vγ1-8／A呈单克隆性。结论 对于年龄较大、病程较长的毛囊黏蛋白沉积症患者，应行TCRγ基因重排检查，以排除淋巴瘤。

摘要：目的:探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)bcl-2/IgH基因重排与分子亚型生发中心样(GCB)的相关性.方法:采用自行设计的半巢式PCR对60例DLBCL的bcl-2/IgH基因重排进行了检测,并对阳性产物进行克隆、测序.同时采用免疫组化SP法在组织微阵列上同步观测CD20,CD10,Bcl-6,黑色素瘤相关抗原(突变体)1(MUM1)的表达,进行GCB和非生发中心样(non-GCB)分子分类.结果:经常规法扩增bcl-2/IgH,有6/60例DLBCLbcl-2/IgH阳性;在6例阳性样本中,采用本组设计的半巢式PCR扩增,经克隆及测序证实5例bcl-2/IgH基因重排阳性,1例为人类第19号染色体BAC331191基因的片段.60例DLBCLCD20表达全部阳性;CD10,Bcl-6,MUM1的阳性表达率分别为43.3%,46.7%,61.7%;GCB32(53.3%)例,non-GCB28(46.7%)例.bcl-2/IgH基因重排阳性的病例均属GCB分子亚型,且与CD10表达有显著性相关(P=0.012),而与Bcl-6及MUM1表达无相关性.结论:使用本组设计的半巢式PCR可提高bcl-2/IgH基因重排检测的准确性.bcl-2/IgH基因重排的检测可协助确定部分GCB分子亚型的DLBCL.

摘要：目的建立免疫球蛋白重链(IgH)的实时定量(RQ)-PCR 检测体系,以用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)微小残留病(MRD)检测。方法采用定性 PCR 筛选109例儿童 B 细胞 ALL(B-ALL)IgH 基因单克隆重排,根据连接区序列设计等位基因特异性引物,应用 RQ-PCR 技术,采用胚系 Taqman 探针与引物,在41例患儿中建立 RQ-PCR 定量检测方法,并分析其敏感度、特异性等。结果109例儿童 B-ALL 初诊标本中 IgH 单克隆重排有48例,经测序分析发现,V、D、J 片段频率最高的分别为 V3家族、D3家族和 J4家族。RQ-PCR 方法扩增48例 IgH 单克隆重排的初诊 DNA,其中41例可重复敏感度和最大敏感度均≤10^(-4),非特异性扩增的循环阈值(Ct 值)均>40,与特异性扩增 Ct值的差距均>3。标准曲线斜率均值为-3.31±0.19,截距均值为37.66±1.23,相关系数均为0.97以上。结论以 IgH 基因重排为靶分子,采用 RQ-PCR 方法和胚系探针策略检测儿童 B-ALL,敏感性≤10^(-4),并具有较高的特异性,适于 MRD 的定量研究。

摘要：背景:淋巴细胞特异性重组激活基因编码的重组激活基因1与重组激活基因2蛋白是参与V(D)J重排机制的重要的重组酶。除参与V(D)J重排以外,近年的研究结果表明重组激活基因介导的转位作用可能与染色体易位及淋巴性恶性肿瘤的发生有关,但迄今尚未有明确定论。目的:检测重组激活基因、DNA修复因子Ku70/Ku80和末端脱氧核苷转移酶mRNA表达以及T细胞受体基因重排在人白血病和淋巴瘤细胞株的发生情况。设计:重复测量实验。单位:南方医科大学生物技术学院分子免疫研究所。材料:T淋巴白血病细胞株Jurkat和6T-CEM购自上海细胞生物研究所;T淋巴白血病细胞株Molt-4,皮肤T细胞淋巴瘤细胞株HuT102,Burkitt’s淋巴瘤细胞株Raji和Daudi以及原髓细胞白血病细胞株HL-60和慢性髓原白血病细胞株K562均由本实验室保存。细胞用含有体积分数0.1胎牛血清的RPMI1640培养基于37℃,体积分数0.05CO2条件下培养。方法:实验于2005-10/2006-01在南方医科大学生物技术学院分子免疫研究所完成。采用反转录聚合酶链反应检测重组激活基因1,重组激活基因2,非同源末端连接装置途径中的DNA修复因子Ku70/Ku80,以及末端脱氧核苷转移酶mRNA表达;采用巢式、半巢式聚合酶链反应、连接介导的聚合酶链反应等方法检测T细胞受体重排删除DNA环和T细胞受体β链重组信号序列两端的断裂点。了解参与V(D)J重排过程的基因表达和T细胞受体基因重排中间体的产生情况。主要观察指标:重组激活基因、DNA修复因子Ku70/Ku80和末端脱氧核苷转移酶mRNA表达以及T细胞受体基因重排在人白血病和淋巴瘤细胞株的发生情况。结果:反转录聚合酶链反应检测结果显示:重组激活基因1mRNA在4种T细胞株中均被检测到,在两种B细胞株和两种髓性白血病细胞株中未检测到;重组激活基因2和末端脱氧核苷转移酶mRNA表达仅在Jurkat,Molt-4和6T-CEM3种T细胞株中检测到,但在6T-CEM表达较弱;除HL-60细胞未检测到Ku80表达外,所有细胞株均检测到Ku70和Ku80表达。对4种T细胞株T细胞受体重排中间体检测结果表明:仅在Jurkat细胞中检测到Dβ2-Jβ2sjTRECs与Dβ25’端和3’RSS断点,表明Jurkat细胞发生T细胞受体基因重排。同时发现JurkatTCRDβ2-Jβ2重排删除环结合区具有明显的多样性特征。结论:重组激活基因可能与T细胞白血病具有更为密切的关系。Jurkat细胞有可能成为研究重组激活基因与T细胞淋巴性肿瘤的一个潜在的细胞模型。

摘要：目的:建立多重PCR方法扩增α/βTCR全长序列,分析活动性肺结核患者病变局部T淋巴细胞α/βTCR基因重排特点及CDR3谱型。方法:分离结核患者肺泡灌洗液中的淋巴细胞,提取RNA后用SMART方法逆转录,运用根据现有文献设计的α和βTCR扩增引物,进行多重PCR扩增以获得其全长序列,构建重组质粒并测序,利用DNAstar及网上TCR资源分析序列。结果:3例患者共获得24个α链序列,13个β链序列。α链以AV1S2(54%)、AV12S3(41%)、AV12S2(5%)为主;β链以BV2(38%)、BV29S1(46%)、BV14(3%)、BV4S2(3%)为主。同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性,但是标本1、标本3各有一条β链的CDR3氨基酸序列相同:SVGTGTLHQETQY;标本2和标本3的各有2条α链CDR3序列相同:AVRDWAGNMLT;标本2的一个α链和标本3的一个α链的CDR3均有:AV…DNN…RLM序列。结论:建立了TCRα和β链全长序列的多重PCR扩增方法。结核患者病变局部克隆性增殖的TCRα和β链谱型呈限制性取用,克隆增生的T淋巴细胞来自不同的亚群,但是相同的CDR3序列对于识别MTB多肽可能具有特异性。