摘要：目的探讨原核表达稀释复性的可溶性人FcγRⅡa（shuFcγRⅡa）的胞外区蛋白在体外与配体的结合活性。方法应用PCR技术从重组质粒pc3huRⅡ中扩增huFcγRⅡa的胞外区基因，将其克隆于原核表达载体pET-28a中。所构建的重组质粒经PCR和酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，制备融合蛋白包涵体。并采用多次洗涤法分离和纯化包涵体，用稀释法对纯化后的目的蛋白进行复性，ELISA和流式细胞术测定重组shuRⅡ在体外与配体的结合活性。结果扩增到了huFcγRⅡa的胞外区基因，所构建的pETshuRⅡ重组质粒经PCR和酶切鉴定与设计序列一致。转化B121（DE3）后，IPTG诱导目的蛋白表达率约为30％。SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量（Mr）约为24．8×10^3，与理论预期值一致。破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达，经多次洗涤后蛋白纯度大于90％。ELISA法测得重组shuRⅡ与人IgG在体外有良好的结合活性，流式细胞术测得重组shuRⅡ对配体与受体结合有抑制作用。结论本复性方法可得到和天然蛋白类似生物学活性的目的蛋白。

摘要：目的通过实验设计(Design of Experiment,DoE)方法对重组的可溶性人肿瘤坏死因子αⅠ型受体(soluble tumor necrosis factorαreceptorⅠ,sTNFαRⅠ)包涵体复性工艺中的关键参数进行优化。方法采用DoE软件中的中心复合设计(Central Composite Design)建立二次模型(Quadratic Model),对复性工艺中游离巯基浓度(C_(-SH))和复性液蛋白浓度(C-Pro)2个关键参数进行优化。设置2个响应值:每克湿菌体中所获得的sTNFαRⅠ蛋白收率和每制备10 g sTNFαRⅠ蛋白所需复性体积(V-10 g),通过DoE软件对模型数据进行评估分析。在sTNFαRⅠ收率最高及V_(-10g)最小的前提下,采用二次模型响应面分析预测最优的复性参数值,并通过两次放大试验对优化结果进行验证。结果由2因素5水平2个Block共14组试验结果所建立的DoE响应面二次模型中心点重复性好,试验点均符合正态分布。响应面二次回归分析中,分别以sTNFαRⅠ收率和V_(-10g)作为响应值进行失拟检验的P均>0.05,模型失拟不显著。预测值和真实值接近,模型拟合度好。信噪比均>4,表明该模型有效,可用于复性工艺优化指导。通过以上模型得出:当C_(-Pro)为0.48 mg/m L,复性起始C_(-SH)为8.69 mmol/L时模型愿望值(0.643)最高,sTNFαRⅠ收率为16.38 mg/g,V_(-10g)为36.73 L。通过两次放大试验对优化结果进行验证,sTNFαRⅠ收率分别为11.34和9.72 mg/g,与优化前(收率均值5.1 mg/g)相比,有所提高。结论 DoE软件中心复合设计的二次模型可用于sTNFαRⅠ包涵体复性条件的筛选,且筛选结果为后续工艺放大提供了可靠的实验依据。

摘要：变性蛋白表面的疏水氨基酸残基有与疏水色谱固定相（STHIC）颗粒相互作用的倾向,两者之间的疏水相互作用能够抑制变性蛋白分子间的相互聚集.同时疏水色谱固定相还能在分子水平上给变性蛋白分子提供足够高的能量,使其瞬时脱水并折叠成其天然构象或不同的折叠中间体.变性蛋白在疏水界面上的折叠不仅取决于其氨基酸之间的特异性相互作用及疏水色谱固定相的结构,而且还取决于固定相和流动相之间的协同作用.同时,还提出了高效疏水相互色谱（HPHIC）进行蛋白折叠的机理及其进行蛋白折叠时能实现质量控制的原理.在适当的色谱条件下,HPHIC可使几种变性蛋白一步实现复性及同时纯化.此外,还设计制造出了直径比柱长大得多的实验室型和制备型“变性蛋白复性及同时纯化装置,USRPP”,该“装置”具有完全除去变性剂、使蛋白质复性,与杂蛋白分离及易于回收变性剂的“一石四鸟”功能.该“装置”对变性蛋白的复性和纯化效率与通常使用的长柱相当.在制备规模情况下,该“装置”可以在低压梯度条件下简便、快速、而经济地应用于重组蛋白药物的制备.文中以重组人干扰素-γ为例,说明了制备型“装置”在其复性及同时纯化生产工艺中的应用.

摘要：为克隆尖吻蝮蛇C型凝集素类蛋白基因至表达载体pBV2 2 0 ,在该载体的多克隆位点上选择适当的酶切位点 ,设计PCR引物 :在目的基因上、下游引物的 5′ 端分别加上对应于载体的粘性末端序列 ,建立两个单独反应体系 ,每个反应体系中只加入一种引物 ,用PfuDNA聚合酶催化模板DNA单链扩增 ;将所得的两种单链产物在适当条件下进行复性后直接与经过酶切的载体DNA连接 ,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,获得足够数量的转化子 .经PCR鉴定单菌落中有目标DNA片段插入 ,测序表明克隆连接正确 .该方法以其简捷性和有效性 。

摘要：将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达的包涵体经超声波破碎、洗涤后以6 mol/L的盐酸胍溶解,使蛋白彻底变性。然后按照试验设计,考察不同浓度组成的人工分子伴侣体系对不同浓度鸡IL-18重组蛋白复性率的影响。试验结果表明,利用人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性存在最佳的条件,优化该条件能够提高该融合蛋白的复性率,且产物都具有良好的生物学活性,为鸡IL-18重组蛋白的进一步应用研究奠定了基础。

摘要：通过DOE(Design of experiment)的方法研究干扰素α-2a(IFNα-2a)蛋白的复性条件,以获得适宜的工业生产条件。以包涵体(Inclusion body,IB)形式在大肠杆菌体内表达的干扰素α-2a蛋白,经过变性、复性后折叠形成天然结构的活性蛋白。通过稀释复性的方法,并对复性液的pH、精氨酸浓度及复性时间进行DOE设计和考察,获得了上述复性参数的工艺范围:复性时间50~60 h,pH(9.9±0.1),精氨酸浓度0.3~0.5 mol/L。复性率为35%~42%,19 min杂质(峰后)小于15%。最终结果表明,精氨酸能有效抑制复性过程中蛋白质的聚集,提高干扰素α-2a折叠效率;从而提高产品收率及该产品的经济效益;pH值的合理选择和复性时间的有效延长可降低19 min杂质含量,进而降低纯化成本。

摘要：根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列,运用生物信息学方法,找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689。根据该基因序列,设计引物直接PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl。anl全长1044bp,含3个内含子,编码297个氨基酸(含信号肽27个氨基酸),与其它脂肪酶基因没有明显同源性。将编码成熟脂肪酶的anl连接到pET28a载体上得到重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(De3),诱导表达并纯化出目的蛋白。通过大量稀释和DEAESepharoseFastFlow层析相结合的方法,变性后的纯化蛋白在体外实现再折叠复性。

摘要：目的在大肠杆菌中高效表达小细胞肺癌单抗2F7的单链抗体(ScFv),并获得具有生物学活性的ScFv。方法利用:PCR方法将2F7单抗重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一人工设计的柔性连接肽(Linker)连接,再将单链抗体基因重组到原核表达载体pQE31中,构建单链抗体高效表达载体pQE-2F7-ScFv。将pQE-2F7-ScFv质粒转化大肠杆菌M15后诱导表达,并对表达产物进行纯化和稀释复性。结果 获得了2F7单链抗体的高效表达,表达蛋白大小约27.4kD,以包涵体形式存在。包涵体蛋白在经过变性、纯化和稀释复性后,获得了有功能的单链抗体。结论 成功地构建和表达了小细胞肺癌单抗2F7的单链抗体,并对其进行了纯化和复性,将进一步促进2F7单抗小分子抗体的应用。

摘要：近几年，曾经一度热闹的当代艺术进入相对冷静期后，能够深悉市场交易脉络，并掌握一线核心资源的当代艺术品经纪人越来越少，而李苏桥是为数不多，依然笃信当代艺术的未来，并愿意发表自己见解的知名经纪人之一。

摘要：一、研究背景1概论（1）医院康复性景观简介医疗康复花园通过园艺活动使患者达到健身养性的目的，不仅对使患者的身体和精神方面具有良好的辅助疗效，还能够帮助患者提高社会意识。康复花园的设计原则有源于经验的，也有基于常识的，是目前所知的最好的康复花园的设计原则，能带来积极的康复效果。现在西方国家的设计师们运用康复花园的经验和理念，在医疗诊断的基础上针对特殊病人对花园的要求设计花园。还有专门为成人和儿童生理复原、精神治疗、老年痴呆、烧伤、艾滋和癌症患者建造的花园等，有很多领域有待深入研究。