摘要：目的建立一种催化发夹自组装(CHA)联合成簇间隔的短回文重复序列及其关联蛋白12a(CRISPR-Cas12a)的传感技术,用于外泌体源性微小RNA-21(miR-21)的检测并分析其性能。方法选取2023年9—10月在陆军军医大学第一附属医院确诊为乳腺癌的患者8例为乳腺癌组;选取同期健康体检者8名为健康对照组。采用试剂盒提取血浆外泌体及其miR-21。针对miR-21序列设计DNA发夹和CRISPR RNA序列。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光分光光度计验证检测技术可行性。进一步优化发夹浓度、CHA反应时间、Cas12a蛋白浓度和Cas12a蛋白反应时间。在此基础上,检测不同浓度(0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 nmol/L)的miR-21,收集荧光强度采用一元线性回归方法做线性分析以评价方法学的灵敏度,同时检测不同类型miRNA(miR-31、miR-26a、miR-192、miR-25-3p)及空白对照以评价方法学特异性。采用病例对照研究,用该检测技术和逆转录PCR方法检测乳腺癌组和健康对照组血浆外泌体源性miR-21的相对表达水平以评价其临床样本检测能力。结果应用CHA联合CRISPR-Cas12a技术建立了外泌体源性miR-21的检测方法。该方法检测miR-21的浓度与荧光强度呈良好的线性关系(相关系数为0.9667),线性检测范围为0.1~10.0 nmol/L,检测限为87.81 pmol/L。miR-21的检测荧光强度为450.27±23.96,高于miR-31、miR-26a、miR-192、miR-25-3p和空白对照组(分别为98.89±7.35、98.12±2.07、98.93±2.45、96.66±2.45、82.93±3.54),差异均有统计学意义(P均0.05)。结论建立了CHA联合CRISPR-Cas12a检测外泌体源性miR-21的高灵敏度与高特异性的传感技术,其检测血浆外泌体源性miR-21的结果与逆转录PCR结果一致,可用于乳腺癌患者筛查。

摘要：背景:利用外泌体作为药物载体不仅可以精确靶向治疗部位,还能提高局部浓度,为药物进入中枢神经系统开辟了一条新途径。目的:探讨外泌体的生物发生、生物学功能,综述当前有关细胞外囊泡作为药物载体在中枢神经系统疾病治疗中的最新进展。方法:由第一作者检索Web of Science、Pub Med和中国知网数据库1976年1月至2024年1月发表的相关文献,以“exosomes,extracellular vesicles,central nervous system,drug delivery,ischemic stroke,Alzheimer’s disease,Parkinson’s disease,spinal cord injury,brain tumor”为英文检索词,以“外泌体,细胞外囊泡,中枢神经系统疾病,载药,脑卒中,阿尔兹海默病,帕金森病,脊髓损伤、脑肿瘤”为中文检索词,最终纳入94篇文献进行分析。结果与结论:(1)外泌体可以轻易通过血脑屏障输送蛋白质、代谢物和核酸到受体细胞中,调节细胞代谢。由于外泌体是由细胞分泌的小囊泡,具有更低的循环免疫原性,在体内循环中能够更少被巨噬细胞识别清除。(2)外泌体可以被设计为递送不同的治疗成分,包括RNA、蛋白质、化疗药物和免疫调节剂,能够将治疗成分传送至期望的目标。经过工程修饰的外泌体具有更好的靶向性,并且这种外泌体介导的传递免疫原性极低,有望为将来中枢神经系统疾病的精准治疗提供更加安全有效的方法。

摘要：目的探讨巨噬细胞来源外泌体对白念珠菌(CA)形态转换的影响及其作用机制。方法体外培养人急性单核细胞白血病细胞系THP-1,采用佛波酯诱导其分化成M0巨噬细胞。活化CA并配置其菌悬液,感染M0巨噬细胞,并于高内涵成像分析系统下观察细胞吞噬现象。采用差速离心法分别提取M0巨噬细胞来源的外泌体(外泌体组)及CA感染M0巨噬细胞后分泌的外泌体(CA外泌体组),并通过透射电镜观察、纳米颗粒跟踪分析、Western印迹法检测外泌体表面标志蛋白来鉴定并比较两组外泌体。将这两组外泌体分别与CA共培养(外泌体处理组、CA外泌体处理组),CA独立培养作为空白对照组,倒置显微镜下观察上述3组CA的形态变化,酶联免疫吸附试验检测胞内环磷酸腺苷(cAMP)含量,实时荧光定量PCR检测cAMP相关基因RAS1及CDC35(也称Cyr1)的表达水平。结果Western印迹检测显示,外泌体组和CA外泌体组外泌体均表达外泌体标志物肿瘤易感基因101蛋白(TSG101),均不表达阴性标志蛋白钙联蛋白(calnexin);透射电镜观察及纳米颗粒跟踪分析显示,两组外泌体形态、大小无明显差异。倒置显微镜观察显示,与空白对照组相比,外泌体处理组及CA外泌体处理组CA由酵母相向菌丝相的转换明显受到抑制,其菌丝长度也明显缩短。酶联免疫吸附试验结果显示,外泌体处理组及CA外泌体处理组CA细胞内cAMP含量[分别为(16.70±0.84)和(16.82±0.87)pmol/ml]均显著低于空白对照组[(21.82±1.08)pmol/ml;t=6.45、6.23,均P=0.003]。实时荧光定量PCR结果显示,外泌体处理组及CA外泌体处理组CA cAMP相关基因RAS1及CDC35表达均较空白对照组下调(均P<0.01),且CA外泌体处理组RAS1 mRNA表达量低于外泌体处理组(t=7.43,P=0.002)。结论M0巨噬细胞外泌体以及M0巨噬细胞感染CA后外泌体均能有效抑制CA菌丝的生长,且后者抑制作用更强,其作用机制可能是通过下调cAMP/蛋白激酶A通路中的cAMP实现。

摘要：外泌体是一类细胞外囊泡,广泛存在于血液、尿液、乳汁中,可用作疾病诊断标志物、药物载体等,是目前化学相关领域的研究热点。本文设计开发出“牛奶中外泌体的分离与鉴定”这一科研创新实验,包含盐析及等电点法分离蛋白质、聚合物沉淀法提取外泌体、BCA法测定蛋白质含量、纳米金颗粒的合成、目测比色法特异性检测外泌体等五部分内容。本实验立足《化学类专业化学实验教学建议内容》和《化学类专业教学质量国家标准》,结合本科阶段教学内容,涉及无机化学、分析化学、生物化学、物理化学、材料化学等多个二级学科,在巩固学生基础实验技能、提升科学素养的同时,进一步培养学生科研探索及解决复杂问题的思维和能力。本实验模块化强,既可组合在一起作为科研创新实验,亦可拆分作为相应二级学科教学实验,十分契合不同层次的实验教学要求。

摘要：缺血性脑血管病(ICVD)是指局部脑组织由于供血障碍发生的变性、坏死或是一过性的功能丧失,是神经系统常见疾病之一。外泌体是细胞外囊泡的一个亚群,具有生物相容性好、毒性和免疫原性低、可设计性强等特点。外泌体的成分包括蛋白质、脂质、遗传物质等,其来源广泛,可由多种细胞在生理或病理情况下分泌。不同来源的外泌体在ICVD治疗中的作用及相关机制不同。本文综述了间充质干细胞、脑细胞、血液、内皮细胞、巨噬细胞来源的外泌体对ICVD的治疗作用及相关机制,以期为ICVD的临床治疗提供参考。

摘要：本研究从围胚胎着床期的湖羊血浆中提取外泌体并进行miRNA测序,发现在着床前、着床期、着床后的湖羊血浆外泌体中存在显著差异表达的miRNA。着床期与着床前有36个差异表达miRNA,其中17个上调,19个下调;着床后与着床期有23个差异表达miRNA,其中7个上调,16个下调。通过BLAST软件比对GO、KEGG等数据库信息,对差异表达的miRNA靶基因进行注释,分析差异表达miRNA靶基因及其相关生物过程,发现富集的生物过程与胚胎着床的过程相关。其中miR-451的表达量较高且在胚胎着床期、着床后与着床前相比差异显著,可能在胚胎着床过程中发挥作用。通过荧光定量PCR检测证明miR-451表达量变化趋势与测序结果一致。本研究提示血浆外泌体miRNA可能参与了湖羊胚胎着床过程的调控。本研究为绵羊胚胎着床调控过程提供了新见解,可能有助于设计绵羊妊娠识别手段,并提高绵羊繁殖效率。

摘要：外泌体是新兴的重要癌症生物标志物。有效检测外泌体和外泌体内容物,特别是microRNA (miRNA),对于癌症的诊断和治疗是迫切且具有挑战性的。基于双链特异性核酸酶(Duplex specific nuclease, DSN)的特异性识别和消化能力,我们设计了一个2’-O-甲基修饰的分子信标(2’-O-methyl-modified molecular beacon, omMB),并开发了一个高灵敏度和特异性分析外泌体miRNA的信号放大检测平台。该方法以A375细胞分泌的外泌体为模型,以microRNA-21 (miR-21)为模型miRNA分子,可以检测到低至37.9 pM的miRNA和2 μg/mL的裂解外泌体。同时,与许多已开发的DSN辅助信号放大方法相比,新方法具有较高的特异性,可以区分错配miRNA。总之,这项工作为医学分析、临床应用和疾病诊断中的外泌体检测提供了一种有效的分析策略。

摘要：目的构建微流控器官芯片,并评估其在模拟骨关节炎进程中软骨下骨骨重塑的能力。方法基于微流控技术和细胞共培养技术设计芯片主体,MC3T3-E1细胞贴壁培养在细胞接种小室的内部,在细胞接种小室的底部以0.5 ml/min的流速灌流培养基。评价指标:(1)微流控器官芯片的评价:灌流生长培养基,采用模拟仿真实验测试不同时间点细胞接种小室内部和底部液体的浓度差和平衡时间;活死染色观察细胞在设定流速下连续培养3、7 d的生物相容性,分为3 d组和7 d组。(2)微流控器官芯片的促成骨作用:灌流成骨诱导培养基,通过碱性磷酸酶(ALP)染色和PCR比较细胞在静态和灌流条件下3、7 d的黑色ALP阳性细胞数量和成骨相关标志基因成骨特异性转录因子2(RUNX2)、Ⅰ型胶原(COL1A1)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨钙素(OCN)的表达情况,分为静态未诱导组、静态诱导组和灌流诱导组。(3)三种成骨细胞亚型外泌体(EVs)的形态和大小表征及生物相容性:获取三种不同细胞亚型[内皮型成骨细胞(EnOB)-EVs、基质型成骨细胞(StOB)-EVs和矿化型成骨细胞(MinOB)-EVs],通过透射电镜和粒径分析获取形态和大小;灌流含有三种不同细胞亚型EVs的生长培养基,通过细胞增殖/凋亡检测实验比较添加不同EVs浓度(1、1.25、2.5、5μg/ml)24 h的生物相容性,分为EnOB-EVs组、StOB-EVs组、MinOB-EVs组。(4)三种成骨细胞亚型EVs的促成骨作用:灌流含有三种不同细胞亚型EVs的成骨诱导培养基3 d,通过ALP染色和PCR比较黑色ALP阳性细胞数量和成骨相关标志基因RUNX2、COL1A1、BMP-2、OCN的表达情况,分为无EVs组、EnOB-EVs组、StOB-EVs组和MinOB-EVs组。结果(1)微流控器官芯片的评价:模拟仿真结果显示,在持续灌流12 h后,上室最上层浓度达到下室浓度的95%以上,最下层为下室浓度的96.5%左右,上下室的浓度差达到平衡状态。活死染色结果表明,芯片在0.5 ml/min的流速下,生物相容性好,灌流3、7 d细胞存活率分别为(99.48±0.12)%、(97.07±1.05)%(P0.05);静态未诱导组COL1A1、BMP-2、OCN表达水平分别为1.00±0.03、1.00±0.13、1.00±0.09,静态诱导组分别为9.38±0.25、14.27±4.35、84.01±4.02,灌流诱导组分别为2.39±0.08、133.64±8.87、86.64±8.36(P<0.01)。3、7 d时静态未诱导组、静态诱导组和灌流诱导组相互比较,均为灌流诱导组的促成骨能力最强。(3)三种成骨细胞亚型EVs的形态和大小表征及生物相容性:透射电镜下EnOB-EVs、StOB-EVs、MinOB-EVs均为典型的茶托状形态。粒径分析结果显示,EnOB-EVs、StOB-EVs、MinOB-EVs的大小分别为(91.3±14.7)nm、(106.0±16.0)nm、(68.1±10.7)nm。细胞增殖/凋亡检测结果显示,EnOB-EVs、StOB-EVs、MinOB-EVs的最佳给药浓度均为1.25μg/ml。(4)微流控器官芯片对于三种EVs促成骨功能验证:ALP染色结果显示,无EVs组黑色ALP阳性细胞最少,添加EnOB-EVs组其次,StOB-EVs组再者,MinOB-EVs组最多。PCR结果显示,无EVs组RUNX2、COL1A1、BMP-2、OCN表达水平分别为1.00±0.01、1.00±0.03、1.00±0.02、1.00±0.02,EnOB-EVs组分别为1.95±0.11、6.78±2.04、7.99±0.57、6.93±3.83,StOB-EVs组分别为0.79±0.12、5.68±1.53、12.59±3.15、25.59±0.95,MinOB-EVs组分别为0.68±0.

摘要：mRNA是一种单链核糖核酸,由一条DNA转录而成,携带蛋白质合成的编码信息,进一步转录并加工成功能蛋白。在基因工程的协同下,合成的mRNA在结构上类似于天然mRNA,使患者能够在自己的身体中产生治疗性蛋白质,从而达到预防或治疗疾病的目的。mRNA治疗避免了其遗传物质整合宿主基因组的风险,也不需要进入细胞核进行转染,它甚至可以在不分裂的细胞中表达。因此,基于mRNA的基因疗法成为极具潜力的临床治疗手段。高效、安全地递送mRNA是其临床应用的两个主要制约因素。目前虽然已有很多报道通过修饰mRNA的结构来提高其稳定性和耐受性,但mRNA的递送效果仍然有待提高。近年来,纳米生物技术取得的重大进展为mRNA纳米载体开发提供了技术支撑。纳米载体能够克服递送过程中的生理障碍,使mRNA到达目标部位。本文介绍了纳米给药系统的设计原则和研究热点。重点聚焦新兴纳米载体在mRNA传递中发挥的作用以及在递送功能研究方面的最新进展;最后,对mRNA的纳米载体递送技术发展前景进行了展望。

摘要：外泌体是一种纳米级别的细胞外微小囊泡, 以往认为它是在细胞代谢过程中产生的废料, 然而近期的研究发现它含有种类丰富的生物活性内容物, 可以进行细胞通信、疾病传递、基因编辑等多种生理活动, 而在精神分裂症患者外周血收集到的外泌体中发现其内容物与健康对照相比具有较大差异。本文简要介绍并综述了外泌体及其内容物作为精神分裂症标志物的实用性、所存在的缺陷以及未来的发展。