摘要：目的建立针对阪崎肠杆菌的高灵敏、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应(PCR)快速检测体系。方法根据阪崎肠杆菌基因组16SrRNA～23SrRNA的内部转录间隔区(ITS)基因和外膜蛋白a(OmpA)基因的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性。结果实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系对阪崎肠杆菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对阪崎肠杆菌基因组的检测灵敏度为4×10-1pg/反应体系;该检测体系在检测50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增,整个反应在2h内完成。结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan PCR检测体系可作为阪崎肠杆菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时检测阪崎肠杆菌的致病力。

摘要：为了研究禽多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白a(Omp A)的免疫原性,根据C48-1菌株Omp A基因序列设计一对特异性引物,采用PCR方法扩增去信号肽的成熟Omp A基因.将去信号肽的成熟Omp A基因扩增片段双酶切后,克隆到p GEX-6p-1表达载体中,构建重组表达质粒p GEX-Omp A,转化宿主菌BL21并经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.SDS-PAGE的结果显示,融合蛋白GST-Omp A大小约为63 ku,与预期的分子质量相符.免疫印迹分析结果表明,该融合蛋白与鸡抗Pm血清具有明显的免疫反应,说明Omp A具有良好的抗原性,这为禽Pm Omp A在免疫防御研究中的应用奠定了基础.

摘要：目的为进一步了解我国斑点热群立克次体存在的多样性,发现可能存在的斑点热群立克次体新成员、潜在媒介和动物宿主。方法建立了扩增斑点热群立克次体190kDa rOmpA基因片段的PCR检测、鉴定方法,并用此方法检测了采自福建省和内蒙古自治区的蜱、动物和人血液标本。对扩增于越原血蜱、森林革蜱和FNH97未鉴定菌株的PCR产物采用PHYLIP软件包进行了序列分析。同时,为了寻找特异的斑点热群立克次体分类检测方法,建立了针对四种斑点热群立克次体的半巢式PCR方法,并对斑点热立克次体阳性标本进行了分类检测。结果采用 190kDa rOmpA.701/70p引物可以从7株斑点热群立克次体中的6株扩增出外膜蛋白a基因片段(小蛛立克次体除外)。并从采自福建省和内蒙古自治区的多种蜱及野生动物、人血液标本中扩增出了斑点热立克次体DNA片段,其中越原血蜱、卵形硬蜱、中华硬蜱、豪猪血蜱、森林革蜱、野鼠血块和人群血块的阳性率分别为15.69％、56.94％、8.70％、7.70％、43.56％、82.51％和0.98％。对来自越原血蜱和森林革蜱以及FNH97菌株的斑点热立克次体190kDa外膜蛋白a630bp左右核苷酸片段序列分析和推测的氨基酸序列分析结果表明:福建越原血蜱立克次体(福建立克次体)核苷酸序列与日本立克次体的该序列同源性最高(94％)。推测氨基酸序列同源性也与该立克次体最高(89％);内蒙古森林革蜱立克次体(森林革蜱立克次体)核苷酸序列与扇头蜱立克次的该序列同源性最高(97％),推测氨基酸序列的同源性也最高(95％)。遗传发育分析,这两种立克次体分别与日本立克次体和扇头蜱立克次体均为同一个分支。序列中限制性核酸内切酶的位点也显示了对应的相似性。但是它们的核苷酸和推测的氨基酸序列与康氏立克次体和西伯利亚立克次体以及内蒙古立克次体(HA-91)差别较大。提示,这两种蜱携带的立克次体可能是我国尚未发现的斑点热群立克欢体新成员。用初步分类引物对蜱标本、血液标本检测结果显示:以“福建立克次体”序列设计的引物检测越原血蜱阳性率为8.49％,卵形硬蜱阳性率为20.83％,中华硬蜱阳性率为4.35％,豪猪血蜱为阴性;以西伯利亚立克次体序列设计的引物检测卵形硬蜱阳性率为 24.39％,越原血蜱阳性率为 5.56％,中华硬蜱和豪猪血蜱均为阴性。以内蒙革蜱立克次体序列设计的引物扩增森林革蜱阳性率为43.56％。结论通过本次研究,在以下方面获得了新的认识:越原血蜱、卵形硬蜱、豪猪血蜱和中华硬蜱是福建南方蜱传斑点热立克次体的媒介或潜在媒介,其中卵形硬蜱、豪猪血蜱和中华硬蜱为我国首次证实的携带斑点热立克次体;福建的越原血蜱和内蒙古的森林革蜱分别携带一种未知斑点热群立克次体,并分别与日本立克次体和肩头蜱立克次体近缘;取自斑点热立克次体rOmpA基因的引物用于PCR,作为一种快速简便手段可直接用于斑点热立克次体初步分类和分子流行病学调查;我国可能存在斑点热群立克次体的多个成员及其自然疫源地。

摘要：目的采用TaqMan探针建立检测沙眼衣原体的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法。方法根据沙眼衣原体外膜蛋白a的基因(ompA)序列设计引物和探针,以克隆的ompA部分基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量检测方法。结果建立的荧光定量PCR检测方法的最低检出限为5 copies/反应,检测线性范围100～107线性关系良好(r2=0.997),比巢式PCR敏感100倍;且与鹦鹉热衣原体、淋球菌、解脲脲原体、大肠杆菌等病原菌DNA以及人基因组DNA均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。以巢式PCR作参比,建立的荧光定量PCR法检测沙眼衣原体的阳性符合率为100.00%,阴性符合率为95.09%,总符合率为96.81%。结论建立的检测沙眼衣原体实时荧光定量PCR具有特异性强和敏感性高的特点,可快速检测样本中微量沙眼衣原体DNA,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选。

摘要：目的为探讨190 kD *** 基因序列对斑点热群立克次体的检测作用。方法从立氏立克次体190 kD 外膜蛋白 A(***)基因序列设计引物,利用 PCR 检测的方法,检测了683只蜱类标本和146个鼠类脏器标本,并随机抽取1株森林革蜱阳性扩增产物进行克隆与序列测定。结果从蜱类标本和鼠类脏器标本中检测出了斑点热立克次体 DNA 片段;所测序列的分型结果表明与前苏联的 DnS 14株型别一致,与我国曾经检测出的斑点热立克次体株差异较大。结论 190kD 外膜蛋白 A 基因序列可用于斑点热立克次体检测,并可用于斑点热群立克次体基因型或亚型之间的鉴别。