摘要：为建立灵敏且特异的多杀性巴氏杆菌(***)快速、可视化临床诊断方法,本试验基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)和侧流免疫层析试纸条(LFD)技术,以多杀性巴氏杆菌种属特异性KmtⅠ基因为模板,设计了用于RPA扩增和nfo RPA扩增的特异性引物、探针,通过琼脂糖凝胶电泳和免疫层吸试纸条分析,筛选最佳引物,优化RPA反应体系并确定最佳反应条件。结果显示,该方法在30℃、20 min内即可获得最佳检测效果,对质粒浓度的最低检测限为2.26×10^(1)copies/μL,且与大肠杆菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门菌无交叉反应;使用RPA basic、RPA-LFD以及普通PCR同时对15份籽鹅临床样品进行检测,结果一致,阳性检出率均为100%,符合率为100%。综上所述,本试验成功建立了多杀性巴氏杆菌的RPA basic与RPA-LFD快速检测方法,具有较高的灵敏度和特异性,操作简单,对仪器、场地要求低,为多杀性巴氏杆菌病的即时诊断和流行病学调查提供了可靠技术支持。

摘要：[目的]建立禽源多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌的可视化检测方法。[方法]将重组酶聚合酶扩增(RPA)与成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas)系统相结合,针对两种病原菌设计特异性CRISPR相关RNA(crRNA)序列,筛选RPA引物,并对CRISPR检测体系进行优化,探究单管双靶标扩增体系,评估检测方法的特异性及灵敏度,验证临床样品检测的可行性。[结果]本研究建立的检测方法最优组合为:Buffer中Mg^(2+)浓度20 mmol/L、Cas12a蛋白80 nmol/L、crRNA 400 nmol/L、ROX荧光探针14μmol/L。特异性及灵敏度检测结果显示,本研究建立的检测方法特异性良好,在蓝光下观察,灵敏度与实时荧光定量PCR一致,比普通PCR高100倍。临床样品检测结果显示,巴氏杆菌、大肠杆菌均被有效检出,本研究所建立方法的临床符合率为100%。[结论]本研究成功建立了禽源多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌的可视化检测方法,其特异性及灵敏度较高,可以准确检测临床样品中的目标病原菌。试验结果为监测与防控禽源细菌性疾病提供了新方法。

摘要：从甘肃省某县一猪场病死猪剖解肺部分离,经过涂片镜检观察,为革兰氏染色为阴性的球杆菌,经过生化试验鉴定初步定为多杀性巴氏杆菌。设计1对引物进行PCR扩增、克隆之后,送往大连宝生物公司测序,测序结果运用BLAST软件比对,与多杀性巴氏杆菌同源性为100%。对分离株进行药敏试验,其对青霉素、链霉素、四环素等抗生素和磺胺类药物敏感。

摘要：为了研究猪多杀性巴氏杆菌IbeB重组蛋白(rIbeB)的免疫保护性,根据GenBank中登录的多杀性巴氏杆菌ibeB基因序列设计1对引物扩增ibeB基因,并重组至pET-28a(+)构建重组表达质粒pET-ibeB,转化到大肠杆菌BL21(D E3),经IPTG诱导获得rIbeB。生物信息学分析表明,猪多杀性巴氏杆菌ibeB基因长1 392 bp,编码蛋白质含463个氨基酸。该蛋白质的理论分子质量为51.98 ku,具有2个外排蛋白结构域,属外膜外排蛋白超家族。蛋白序列比对发现,不同血清型的多杀性巴氏杆菌IbeB的同源性达99%以上。rIbeB诱导小鼠的免疫保护结果表明,第3次免疫后第14天小鼠血清中IgG抗体水平显著升高,明显高于佐剂对照组。攻毒后,对照组小鼠第3天的存活率为20%,7 d后全部死亡;免疫组第3天的存活率达70%,第7天的存活率为40%。结果表明,rIbeB蛋白具有很好的免疫原性,可诱导小鼠产生部分免疫保护力。

摘要：为了研究多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法,试验采用特异性引物对32个经鉴定为巴氏杆菌的菌株以及其他5种常见的病原菌进行了扩增。结果表明:该引物对巴氏杆菌的检出率达到91%,对其他5种病原菌的检测结果均为阴性。说明试验所设计的引物可用于巴氏杆菌感染的诊断。

摘要：本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a(+)-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1044bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a(+)-OmpA重组菌最佳诱导条件为1mmol/LIPTG37℃诱导6h,表达的重组蛋白大小约为40ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C1684H2619N457O505S3,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。

摘要：为建立一种多杀性巴氏杆菌(Pm)快速敏感的检测方法,本实验根据Pm70株kmt1基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了该菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并优化了检测反应条件。本实验建立的荧光定量PCR方法可以特异性检测Pm,而对鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等菌株检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。该方法对C48-1株标准品的检测灵敏度为1.75×10~1拷贝/μL,优于常规PCR检测方法(1.75×10~3拷贝/μL) 100倍;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性。对20份疑似感染的临床病料样品(鸡肝脏、牛肺脏)进行增菌培养和分离鉴定,结果分离到8株多杀性巴氏杆菌;以建立的荧光定量PCR方法与常规PCR方法对增菌培养液进行检测,阳性率分别为40%(8/20)和25%(5/20),且荧光定量PCR方法与常规细菌分离鉴定的符合率为100%。对C48-1株感染致死的20份小鼠肝脏和脾脏组织研磨液进行检测,阳性率均为100%。本研究建立的方法能够快速、敏感的检测Pm,对于其临床和实验室的快速诊断具有重要意义。

摘要：为建立一种敏感特异、简便快速的多杀性巴氏杆菌检测方法,根据多杀性巴氏杆菌kmt1基因保守区序列设计特异性引物和探针,通过对反应条件优化筛选,建立了重组酶介导的等温扩增(RAA)荧光检测方法。结果显示,建立的多杀性巴氏杆菌RAA荧光检测方法在39℃恒温条件下20 min内即可特异性的检出多杀性巴氏杆菌,与鸭疫里默氏杆菌、副猪嗜血杆菌、支原体、链球菌、大肠杆菌、附红细胞体、新孢子虫无交叉反应,方法的最低检出限为10 copies/μL,组内和组间重复性试验的变异系数均小于10%,用该方法对45份临床样本进行检测,结果阳性率为33.33%,与荧光定量PCR方法检测结果一致。本研究建立的多杀性巴氏杆菌荧光RAA检测方法操作简单、反应时间短、具有较高的特异性和敏感性,不依赖于复杂的仪器,适合临床上对多杀性巴氏杆菌的快速检测。

摘要：试验旨在对多杀性巴氏杆菌recN基因进行克隆和原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中recN基因序列(登录号:CP003313.1)设计1对引物,通过PCR扩增获得目的基因片段,构建pET-28a(+)-recN重组质粒并转化*** DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化*** BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 677 bp的recN基因序列,通过诱导表达的His-Tag融合蛋白大小约为66.94 ku,主要以包涵体形式存在。经生物信息学分析,recN蛋白的分子式为C_(2735)H_(4428)N_(786)O_(855)S_(16),消光系数为24 785,不稳定系数为43.99,属于不稳定蛋白;理论等电点(pI)为5.62,为酸性蛋白;总平均亲水性为-0.316,与试验表达的包涵体蛋白性质相同,即同为疏水性蛋白;recN蛋白在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,在酵母(体内)中的半衰期>20 h,在大肠杆菌(体内)中的半衰期>10 h;二级结构主要以α-螺旋(64.87%)及无规则卷曲(21.00%)为主;经疏水性分析,预测该蛋白有3个高疏水性区域和9个高亲水性区域。本试验结果为进一步探究多杀性巴氏杆菌recN基因的功能提供了参考依据。

摘要：为评估猪多杀性巴氏杆菌(Pm)毒力蛋白Dot诱导小鼠产生的免疫保护效果,本研究根据GenBank登录的A型Pm CS株dot基因序列设计特异性引物,以CS株基因组DNA为模板经PCR扩增dot基因片段,PCR产物测序后利用生物信息学软件进行序列分析。结果显示,dot基因长729 bp,编码含242 aa的膜蛋白;该蛋白的N端有一个24 aa组成的信号肽,具有重复Sel 1结构功能域,属于四肽重复超家族;抗原表位分析显示,Pm Dot蛋白含有6个抗原表位;序列同源性分析显示,不同血清型Pm Dot蛋白氨基酸序列的同源性达99%以上。将dot基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中构建重组表达质粒pET-dot,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白,采用His纯化柱纯化后,经SDS-PAGE检测并采用western blot鉴定。结果显示,重组Dot蛋白(rDot)正确表达,且纯化效果较好,具有较强的反应原性。取40只4周龄BALB/c小鼠随机均分为5组进行免疫保护实验,3个实验组分别于0、2周、4周对小鼠通过背部皮下多点注射弗氏不完全佐剂(IFA)+10μg rDot(低剂量组)、IFA+30μg rDot(中剂量组)、IFA+50μg rDot(高剂量组)。两个对照组分别注射等量生理盐水和IFA。共免疫3次,每次间隔2周,小鼠于免疫前和攻毒前,均经尾静脉采血并分离血清,采用ELISA检测血清中IgG抗体水平。第3次免疫后2周,通过腹腔注射10×LD_(50)的A型Pm CS株攻击小鼠,观察攻毒后小鼠的临床症状及死亡情况。结果显示,生理盐水和IFA组小鼠抗体水平无显著差异;实验组小鼠二免后2周和三免后2周IgG抗体水平均极显著高于两个对照组(P<0.01)。攻毒后3 d,对照组小鼠全部死亡,低剂量、中剂量、高剂量组小鼠存活率分别为12.5%(1/8)、50%(4/8)、62.5%(5/8)。攻毒后5 d存活小鼠逐渐恢复并正常采食。本研究表明,rDot具有很好的免疫原性,可诱导小鼠产生部分免疫保护力。该研究为Pm Dot亚单位疫苗的研究积累了基础资料。