摘要：为建立一种能同时检测大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,试验根据大肠杆菌phoA基因、鸭疫里默氏杆菌ompA基因、多杀性巴氏杆菌kmt 1基因、金黄色葡萄球菌FemB基因的保守区域设计4对特异性引物,通过优化退火温度和引物浓度建立多重PCR方法,检验该方法的特异性、敏感性性、重复性,应用该方法检测145份病死水禽临床样品,并与传统细菌分离鉴定方法进行比较。结果表明:优化后的最佳退火温度为52℃,引物浓度为10μmol/L。建立的多重PCR方法能特异性地扩增出靶基因,沙门氏菌、链球菌、产气荚膜梭菌等临床常见菌均未扩增出条带,对大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌4种细菌的检出下限是0.4 pg/mL,单一PCR扩增ompA、kmt 1、phoA和FemB基因的检出下限分别为4×10^(-3),0.4,4×10^(-3),4×10^(-6)pg/mL。多重PCR方法对临床样品的检测结果与传统细菌分离鉴定方法的符合率均在90%以上。说明试验建立的多重PCR方法具有结果稳定、重复性高的特点,适合水禽病原微生物流行病学调查。

摘要：为建立可同时快速检测猪支气管败血波氏杆菌（Bb）、副猪嗜血杆菌（Hps）、胸膜肺炎放线杆菌（App）和多杀性巴氏杆菌（Pm）的四重PCR方法,根据Bb的fla基因、Hps的16S rRNA基因、App的apxⅣ基因和Pm的特异性基因KMT1设计4对特异性引物,基于TaKaRa公司的Premix Taq PCR预混酶,对四重PCR的引物浓度和退火温度进行优化,确定该四重PCR的反应体系和反应条件,通过对特异性及同一种病原菌不同血清型检测的通用性、敏感性和重复性评价,建立快速检测猪这4种呼吸道病原菌的四重PCR方法,同时应用该方法对81份临床样本进行检测,检测结果与这4种病原菌单项PCR检测以及4种病原菌的分离鉴定结果进行比较。结果表明,该方法能同时对这4种病原菌进行检测,特异性和通用性好、重复性好,对这4种病原菌DNA的最低检测质量浓度为20 pg/L,对这4种细菌的最低检出量分别为1×10^3CFU/mL的Pm,1×10^2CFU/mL的Hps、Bb和App,敏感性高。81份临床样本的四重PCR检测结果和单项PCR检测结果一致,PCR检出率明显高于细菌分离鉴定结果。本研究成功建立了可同时检出猪支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的四重PCR方法,该方法可用于临床样本的快速检测以及这4种病原菌的鉴别检测。

摘要：为建立检测家兔铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)和支气管败血波氏杆菌(Brodetella bronchiseptica)的多重PCR检测方法,参考GenBank数据库中登录的铜绿假单胞菌gyrA基因、肺炎克雷伯氏菌rcsA基因、多杀性巴氏杆菌KMT1基因和支气管败血波氏杆菌flaA基因,设计4对特异性引物,建立能同时扩增4种家兔呼吸道致病菌核酸的多重PCR检测方法,并进一步对其特异性和敏感性进行检测。特异性检测结果显示,该方法能同时扩增出4种家兔呼吸道致病菌的核酸,而对兔出血症病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、奇异变形杆菌与肠炎沙门菌无特异性扩增条带,说明该方法特异性良好。敏感性检测结果显示,该方法对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌检测的灵敏度分别为2.5×10^(-1),2.5×10^(0),2.5×10^(-2),2.5×10^(-2)μg/L。用建立的多重PCR方法对临床样本进行检测,结果表明,该方法可以快速并且特异地鉴别4种细菌病原的单独或混合感染,与单一PCR检测方法相比无显著性差异(P>0.05)。该方法的建立为家兔呼吸道疾病临床鉴别诊断和4种细菌病原的分离鉴定提供重要的技术手段。

摘要：为建立牛呼吸道疾病综合征3种常见病原菌多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)和牛支原体(Mycoplasma bovis)的三重TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据3种病原菌的16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,通过反应体系和扩增程序优化,建立了3种病原菌的三重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示,利用建立的方法对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌和牛支原体DNA样品的检测为阳性,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠道沙门菌等牛常见24种细菌DNA样品的检测为阴性,表明该方法特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒pMD-Past、p MD-Mann和p MD-Myco的最低检出限分别为38、45和28 copies/μL,表明该方法敏感性较高;重复性试验结果显示,该方法变异系数≤2.15%,表明该方法重复性较好。利用建立的三重TaqMan荧光定量PCR方法和文献报道的TaqMan荧光定量PCR方法平行检测43份呼吸道疾病病牛的DNA样品,结果显示,两种方法检测多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌和牛支原体的总符合率分别为100%、97.7%和100%。结果表明,本研究建立的三重TaqMan荧光定量PCR方法为牛呼吸道疾病综合征3种常见病原菌的高通量快速检测提供了有效的技术支撑。

摘要：为建立同时检测大肠杆菌、禽源多杀性巴氏杆菌和鸭疫里默氏菌等水禽常见病原菌的环介导间接PCR方法，根据大肠杆菌的gapA基因、禽源多杀性巴氏杆菌的KMTl基因、鸭疫里默氏菌的OmpA基因序列，分别设计引物、标记于猪线粒体基因片段的两端，制备不同细菌的捕获探针；将捕获探针与待检测菌的基因组杂交、补平缺口、环化。采用1对引物反向扩增捕获探针，建立检测水禽3种常见病原菌的环介导间接PCR方法，扩增片段大小分别为328，422和504bp。沙门菌、金黄色葡萄球菌、小鹅瘟病毒的检测结果为阴性。该方法能检测出100Pg的细菌基因组DNA，与常规PCR的符合性为]00％。该方法可用于水禽3种常见病原菌的同时检测，是一种特异性好、灵敏度高的快速病原学诊断方法。

摘要：目的建立检测猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)中肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)、猪链球菌(Streptococcus suis,SS)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)和猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)的四重PCR方法。方法根据GenBank中登录的Mhp的P36基因序列设计引物,同时参考文献分别合成SS、HPS和Pm的特异性引物,通过4因素(Taq酶、Mg2+、引物、dNTPs)4水平的L16(44)正交试验优化PCR反应体系,建立检测Mhp、SS、HPS和Pm的四重PCR方法,并进行特异性、敏感性及重复性验证。运用该方法及单一PCR方法,对PRDC猪的鼻腔拭子及肺脏组织样品进行检测,另对肺脏组织样品进行SS、HPS和Pm的常规分离鉴定。结果确立了四重PCR方法最适反应体系及反应条件;应用建立的四重PCR方法在568、294、821和457 bp处均可见与预期相符的特异性条带,8次重复扩增后的电泳结果一致,最低检测限量分别为560、260、280和200 pg,表明该方法特异性、敏感性及重复性较好;PRDC猪的鼻腔拭子及肺脏组织样品的四重PCR方法检测结果与单一PCR方法相比,差异无统计学意义(P>0.05),四重PCR及单一PCR方法的HPS的检出率则显著高于常规细菌分离鉴定(P<0.05)。结论所建立的四重PCR方法,可直接用于临床PRDC 4种病原菌的鉴定,为开展PRDC流行病学调查提供了有效的技术手段。

摘要：根据GenBank中的羊产气荚膜梭菌(CP)α毒素基因、大肠杆菌(***) K99菌毛毒力因子、肠炎沙门氏菌(SE)外膜蛋白A基因(ompA)、多杀性巴氏杆菌(Pm) K基因序列,设计了4对引物,建立了检测羊产气荚膜梭菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为258bp、 151bp、 384bp、 585bp。敏感性、特异性结果显示,该PCR敏感性分别为羊产气荚膜梭菌6.0ng/L、大肠杆菌4.0ng/L、肠炎沙门氏菌0.4ng/L、多杀性巴氏杆菌4.0ng/L,而金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、结核杆菌等的扩增结果均为阴性。对1094份腹泻病羊粪便的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于绵羊细菌性腹泻病的临床检测。