摘要：目的建立并应用检测儿童下呼吸道感染WU多瘤病毒（WU polyomavirus）的实时荧光定量PCR（real-time fluorescentquantitativePCR，FQ—PCR）方法。方法选择WU多瘤病毒的VP2基因作为检测的目标基因，设计FQ—PCR引物和检测探针，以重组质粒为标准品建立标准曲线，并对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评价；应用该方法对温州医学院附属温岭医院收集的临床下呼吸道感染患儿的痰液、咽拭子846份及血清标本846份进行定量检测。结果本研究建立FQ—PCR检测方法，质粒标准曲线的方差系数为0．998，灵敏度可达到50拷贝；应用该方法检测700份痰液标本，检测到7例阳性标本，146份咽试子标本中未检测到阳性标本，总阳性率为1．00％（7／700），846份血清标本未检测到阳性标本。结论本研究建立的rQ—PCR方法可以特异、快速、灵敏地对儿童下呼吸道感染的WU多瘤病毒进行定量检测；痰液标本较咽拭子或血清标本更适用于WU多瘤病毒感染的核酸检测。

摘要：目的建立儿童新发呼吸道病毒的多重实时荧光定量PCR检测方法，并利用该方法进行临床标本的检测。方法根据人类偏肺病毒、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、人博卡病毒、KI多瘤病毒和wu多瘤病毒的保守区域设计并合成引物和探针，确定引物和探针的特异性，优化引物和探针的组合浓度，通过检测具有类似临床症状的其他病原体的标本评价该多重荧光定量PCR方法的特异性，构建质粒标准品用于分析检测该方法的灵敏度和重复性；并对2009至2012年湖州市妇幼保健院及湖州市中心医院收集的322例呼吸道感染患儿的痰液标本进行检测分析。结果成功建立了这6种新发呼吸道病毒的多重荧光定量PCR检测方法，能够同时或分别对其进行检测。体系中筛选的引物和探针具有很好的特异性，并优化出适合的引物探针组合浓度，灵敏度分析最低检测限为10拷贝数／μl，重复性分析中批内变异系数（CV）为1．2％～3．4％，批间CV为0．08％～0．85％，均小于5％。322份临床标本中，人类偏肺病毒阳性17份，阳性率5．28％，人博卡病毒9份，阳性率2．80％，未检到冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、KI多瘤病毒和WU多瘤病毒。结论多重荧光定量PCR方法具有简单快速，灵敏性和特异度高等特点，并且能实现多种新发病毒同时并行检测，可为儿童呼吸道新发病毒感染的临床诊治提供技术支持。

摘要：目的建立地鼠多瘤病毒（hamster polyomavirus，HaPyV）PCR检测方法，并应用于乙型脑炎减毒活疫苗生产过程中地鼠肾细胞的感染检测。方法设计针对HaPyV衣壳蛋白VP1基因片段的特异引物，以含HaPyV VP1片段的质粒PMDl9T—HaPyV688为模板进行PCR扩增并测序确认扩增产物。以多种病毒DNA为模板进行PCR扩增，并对扩增产物进行斑点杂交鉴定以验证PCR方法的特异性。将定量的质粒PMD19T-HaPyV68810倍系列稀释后进行PCR敏感性检测。以小鼠多瘤病毒（murinepolyomavirus，MuPyV）检验PCR法对质粒DNA和病毒DNA检测的一致性。应用建立的方法对生产用地鼠肾细胞悬液进行HaPyVDNA检测。结果仅含有质粒PMDl9T—HaPyV688和MuPyVDNA的样品能够扩增出600bp的片段，经斑点杂交及测序证明其分别为HaPyV和MuPyV的VPl特异基因片段。PCR所能检出的PMD19T—HaPyV688和MuPyV的最少DNA拷贝数分别为5300和590。7个亚批生产用地鼠肾细胞悬液的HaPyV检测结果均为阴性。结论建立的PCR方法具有较高的敏感性和特异性，可用于生产用地鼠肾细胞HaPyV感染的检测。