摘要：目的克隆三七Panax notoginseng(Burk)***多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP)基因(Pn PGIP)的全长c DNA序列,分析该基因的表达特性。方法根据三七中编码PGIP的EST(expressed sequence tag)序列设计引物,采用c DNA末端快速扩增技术克隆Pn PGIP基因的全长c DNA序列;用q RT-PCR分析Pn PGIP基因的表达水平。结果 PnPGIP基因的cDNA全长为1 171 bp,含有981 bp的开放阅读框,13 bp的5’-非翻译区以及177 bp的3’-非翻译区,编码含326个氨基酸的蛋白质,PnPGIP蛋白的相对分子质量约为36 770,等电点约为5.83;q RT-PCR分析结果显示,Pn PGIP基因的表达量分别在三七接种茄腐镰刀菌和人参链格孢后4 h和2 h内迅速上升;此外,信号分子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)、乙烯利(ethylene,ETH)、H2O2、水杨酸(salicylic acid,SA)处理均能不同程度地诱导Pn PGIP基因的表达水平。结论 PnPGIP基因在转录水平响应茄腐镰刀菌和人参链格孢的侵染,并受几种逆境胁迫相关信号分子的诱导,Pn PGIP基因可能参与三七对茄腐镰刀菌和人参链格孢的防卫反应。

摘要：据GenBank及相关文献提供的序列设计引物,从油菜基因组DNA中扩增出Bnpgip2-1基因完整开放阅读框。该基因全长1 068bp,与已发表的Bnpgip2基因序列(登录号:AF529694)有98%的相似性。RT-PCR分析表明,该基因(已申请序列号为KJ820998)具一个72bp的内含子(544-615),编码区为996bp,含4个限制性内切酶酶切位点(AvaⅠ,185;HindⅢ,536;EcoRⅠ,929;Apa LⅠ,972)。原核表达该基因,表达产物能显著抑制油菜菌核病菌多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性,抑制率达52.96%。生物信息学分析表明,表达产物Bn PGIP2-1有331个氨基酸,理论分子量为36.99k Da,p I为8.35,具强疏水性,主要存在于细胞壁。信号肽切点位于第22和23位氨基酸之间(SFS-KNL),N端和C端各存在5个和3个半胱氨酸残基,可形成3个二硫键;二级结构以α-螺旋(31.12%)、β折叠(16.01%)和无规则线圈(52.87%)为结构元件,具典型的LRR结构;三级结构为10个LRR按右手螺旋规则形成的一个开放裂隙区,可能负责其与病菌PG的互作。该基因的表达受病原菌侵染的强烈诱导,但对水杨酸(SA)处理不敏感,茉莉酸(JA)处理反而使其下调表达。

摘要：【目的】获得诱导型基因Cp PGIP2启动子,并分析该启动子的功能。【方法】以番木瓜Cp PGIP2基因c DNA序列(HQ660394)搜索番木瓜基因组DNA序列,获得一段约2 000 bp的5’端上游DNA序列(ABIM01005077),参照该序列设计PCR特异引物,以番木瓜叶片DNA为模板克隆该启动子,并进行生物信息学分析。将3个启动子片段替换p CAMBIA1301载体中的Ca MV 35S启动子,构建缺失启动子表达载体,以GUS瞬时表达检测缺失启动子表达活性。【结果】获得了Cp PGIP2起始密码子上游长为1 981 bp的调控序列,经分析该序列含有真菌、脱落酸、赤霉素、光照等多种响应元件,为诱导型启动子。构建了1个启动子全长表达载体和2个5’端缺失启动子表达载体,分别命名为p D0-1981、p D1-1204和p D2-261。启动子在番木瓜果肉中的瞬时表达显示,长度为1 204 bp的启动子表达活性最强。并且,该启动子在根、茎、叶、果肉和愈伤组织中均有不同程度的表达,在近外果皮的果肉处和根部表达最明显。【结论】本研究获得了Cp PGIP2启动子序列,确定了表达活性最强的启动子长度,初步分析了启动子的表达模式和顺式作用元件,为进一步深入研究Cp PGIP2基因功能以及将该启动子应用于植物基因工程育种奠定了基础。

摘要：【目的】从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础。【方法】根据Genbank中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序。然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳。对pET-PGIP-X基因工程菌表达产物的可溶性进行检测。【结果】苹果PGIP cDNA序列长为1 091 bp,编码区为993 bp,可编码330个氨基酸残基,将其命名为MdPGIP;重组表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X在宿主大肠杆菌中分别表达出分子质量约49.6和46.1 ku的融合蛋白,pET-PGIP-X表达产物以包涵体的形式存在。【结论】成功克隆了苹果PGIP基因,并在大肠杆菌中获得高效表达。

摘要：【目的】研究克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii ***(Dieck)Langenf]PGIP基因并进行原核表达,探讨其抗病机制。【方法】根据Genbank中已经发表的‘金冠’苹果PGIP保守区域设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段连接到原核表达载体pET30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到*** BL21(DE3)中进行表达。【结果】序列分析表明,新疆红肉苹果PGIP基因cDNA编码区全长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为MsPgip,GenBank登录号为JQ001783。MsPgip分子质量为36.6 kD,等电点为7.05,有6个潜在的N-糖基化位点,信号肽为N端24个氨基酸残基。该蛋白质还具有2个连续的24个氨基酸残基大小的LRR基序(LSQLKNLTFLDLSFNNLTGAIPSSLSQ LPNLNALHLDRN-KLTGHIPIS)。与已克隆的‘澳洲青苹’、‘金冠’、‘富士’苹果PGIP氨基酸序列同源性均高达99%。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达蛋白的分子质量与预期一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。

摘要：以油菜品系甘蓝型油菜宁RS-1为植物材料,以南京油菜田里收集的核盘菌为致病菌,根据已经报道的油菜PGIP基因序列,设计简并引物。从宁RS-1基因组DNA中经PCR克隆到1条包含1个内含子与2个外显子的基因序列。序列比对分析显示,该基因与已公布的油菜PGIP1基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达99%,编码区序列全长984 bp,编码332个氨基酸,富含亮氨酸。以翻译延伸因子EF-1α作为内标,利用半定量RT-PCR分析了BnPGIP基因在核盘菌未诱导和诱导后宁RS-1中的表达量差异。结果发现,核盘菌诱导后宁RS-1中的BnPGIP表达含量明显提高,表明宁RS-1在受到核盘菌侵染后体内的BnPGIP基因受到诱导表达。为进一步研究BnPGIP基因在抗核盘菌侵染的作用,构建了BnPGIP基因过量表达载体。